论文摘要
本课题应用纳米技术,构建了蒙脱石纳米微粒MN、CTAB-柱撑蒙脱石纳米微粒CMN和Al2O3-柱撑蒙脱石纳米微粒AMN,并对其进行表征。以MN作为对照,系统地研究了柱撑后的CMN和AMN对玉米赤霉烯酮（ZEA）、赭曲霉毒素A（OTA）和黄曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）的吸附效果及吸附稳定性和选择性；同时,运用Caco-2细胞模型考察了CMN、AMN和上述六种霉菌毒素对Caco-2细胞的增殖毒性以及CMN和AMN通过吸附对其在Caco-2细胞模型中跨膜转运的影响。主要研究结果如下：1柱撑蒙脱石纳米微粒的构建与表征以钠基蒙脱石、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、AlCl3·6H2O为主要原料,应用纳米科技,构建出蒙脱石纳米微粒MN、柱撑蒙脱石纳米微粒CMN和AMN,比较研究了MN、CMN和AMN的粒径大小和晶体结构。经原子力显微镜分析,CMN和AMN的粒径均小于100nm,经X衍射谱线和红外光谱分析,CTAB和Keggin铝离子以离子交换的方式进入蒙脱石结构单元层间,后者再经500℃高温煅烧后,在蒙脱石层间形成Al203氧化物柱。与MN相比,CMN和AMN经柱撑后doo1层间距增大,分别增加了0.628nm和0.246nm；粒径变小,分别降低了24.77nm和20.56nm。CMN和AMN在分别吸附了ZEA、OTA和AFB1后,形成吸附剂-霉菌毒素复合物,再进行XRD和FTIR分析。XRD分析结果显示,CMN在吸附了ZEA、OTA和AFB1后,其doo1层间距分别增加了0.057nm、0.066nm和0.066nm；AMN在吸附了ZEA、OTA和AFB1后,其doo1层间距分别增加了0.005nm、0.036nm和0.02nm。XRD结果表明,CMN比AMN表现出更优异的吸附性能与霉菌毒素分子能够大量进入其层间有关。FTIR分析显示,CMN和AMN在吸附霉菌毒素分子时,其层间的烷基碳链、Al2O3中的氧原子、霉菌毒素分子结构中的羰基氧原子和不饱和碳-碳双键及碳-氧双键均不同程度地参与其中。2柱撑蒙脱石纳米微粒对霉菌毒素的吸附研究从吸附时间、吸附剂用量、溶液pH、吸附温度、振荡速度以及起始浓度等方面研究了CMN和AMN在体外水相溶液中对ZEA、OTA、AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的吸附效果,同时也考察了CMN和AMN对它们的吸附稳定性和选择性。结果显示,经过柱撑的CMN和AMN对上述六种霉菌毒素均表现出优异的吸附效果,根据Freundlich等温方程,CMN和AMN对ZEA、OTA、AFB1、AFB2AFG1、AFG2的饱和吸附容量分别达到了1830.21μg/g和1034.90μg/g（P<0.05）、3663.53μg/g和2466.61μg/g（P<0.05）、3112.43μg/g和2087.37μg/g（P<0.05）、1479.79μg/g和1210.60μg/g（P<0.05）、1882.35μg/g和523.72μg/g（P<0.05）、975.89μg/g和905.94μg/g（P>0.05）；根据Langmuir等温方程,ZEA、OTA、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2在CMN和AMN上的饱和吸附容量分别达到了1250.00μg/g和1428.57μg/g（P>0.05）、1111.11μg/g和1250.00μg/g（P>0.05）、1428.57μg/g和1666.67（P>0.05）、1111.11μg/g和1111.11μg/g、1250.00μg/g和1250.00μg/g、1000.00μg/g和1111.11μg/g（P>0.05）；而未经柱撑处理的MN的饱和吸附容量根据Freundlich和Langmuir等温方程分别达到了199.34μg/g和555.56μg/g、149.14μg/g和333.33μg/g、1666.67μg/g和1100.27μg/、393.01μg/g和2500.00μg/g、714.29μg/g和258.64.00μg/g、250.09μg/g和1000.00μg/g。与MN相比,有机或无机柱撑均使CMN和AMN对六种霉菌毒素的饱和吸附容量显著提高（P<0.05）。吸附稳定性和选择性研究结果显示,CMN和AMN对上述六种霉菌毒素均具有很强的吸附稳定性和选择性,属于化学吸附,解吸率均在6.0-20.0%范围内,赖氨酸、蛋氨酸、维生素B1、维生素B2、Ca2+和Fe2+等主要饲料养分均未对霉菌毒素的吸附产生显著影响（P>0.05）。CMN和AMN对六种霉菌毒素的吸附速度快,60分钟内即可达到平衡；pH降低和温度升高均有促进其吸附霉菌毒素的趋势（P>0.05）。3柱撑蒙脱石纳米微粒和霉菌毒素对Caco-2细胞增殖的影响采用体外细胞培养技术,以Caco-2为评价细胞系,通过MTT法研究了CMN、AMN、ZEA、OTA、AFB1、AFB2、AFG1和AFG2对Caco-2细胞增殖的影响,同时也考察了添加不同剂量的CMN或AMN对霉菌毒素损伤Caco-2细胞的影响。结果显示：在霉菌毒素添加剂量为250ng/ml、500ng/ml、750ng/ml、1000ng/ml和暴露时间为12h、24h、36h、48h的情况下,六种霉菌毒素均显著降低了Caco-2的相对存活率,在较低浓度和较短的暴露时间里,其对Caco-2细胞的增殖毒性具有明显的量效关系。在CMN和AMN的添加剂量为0.25%、0.5%、0.75%、1.0%和暴露时间为24h、48h、72h的情况下,Caco-2的相对存活率均在88.76%以上；毒性评级结果显示,CMN和AMN对Caco-2的毒性级别仅为1级,符合中华人民共和国国家标准对人体植入材料的细胞毒性不大于1级的规定,可以用于霉菌毒素在Caco-2细胞模型的转运研究。在六种霉菌毒素浓度均为900 ng/ml的细胞培养液中,依次添加质量百分比浓度为0.25%、0.5%、0.75%和1.0%的CMN和AMN,暴露时间为48h，CMN和AMN均能在各个添加剂量显著提高Caco-2的相对存活率（P<0.05）。与添加ZEA的阳性对照相比,二者在不同添加剂量对Caco-2细胞相对存活率的提高幅度分别达到95.2%、101.9%、103.4%、104.8%和55.1%、62.1%、65.6%、72.5%；与添加OTA的阳性对照相比,二者对Caco-2细胞相对存活率的提高幅度分别达到123.9%、137.3%、142.5%、145.4%和80.2%、88.9%、95.0%、104.3%；与添加AFB1的阳性对照相比,二者对Caco-2细胞相对存活率的提高幅度分别达到865.7%、902.5%、917.4%、942.8%和646.5%、680.6%、700.8%、770.0%。与添加AFB2的阳性对照相比,二者对Caco-2细胞相对存活率的提高幅度分别达到716.5%、746.4%、761.7%、771.2%和602.5%、617.9%、640.5%、670.4%。与添加AFG1的阳性对照相比,二者对Caco-2细胞相对存活率的提高幅度分别达到796.4%、833.5%、843.2%、860.9%,和640.6%、600.0%、708.5%、739.1%。与添加AFG2的阳性对照相比,二者对Caco-2细胞相对存活率的提高幅度分别达到605.4%、617.3%、634.7%、646.6%和508.5%、521.6%、537.4%、564.1%。结果显示,在处于高水平霉菌毒素暴露的环境下,CMN和AMN通过吸附霉菌毒素均能有效降低其对Caco-2细胞的损伤。4柱撑蒙脱石纳米微粒对霉菌毒素在Caco-2细胞模型中转运的影响应用Caco-2细胞吸收模型,研究了CMN和AMN在模拟消化道环境中对六种霉菌毒素跨膜转运的影响。试验组AP侧六种霉菌毒素的浓度均为900 ng/ml,CMN和AMN的质量百分比浓度均为0.25%,37℃培养3h,从Caco-2细胞模型的BL侧移取200μl样品液进行HPLC分析,计算各霉菌毒素的跨膜转运率。结果显示：与对照组相比,CMN分别使ZEA、OTA、AFB1、AFB2、AFG1和AFG2在Caco-2细胞单层中的转运率下降了90.78%、93.68%、91.37%、87.95%、90.72%和87.48%（P<0.05）,AMN则分别使之降低了85.34%、88.87%、84.09%、83.74%、87.55%和82.43%（P<0.05）；与AMN相比，CMN也显著降低了六种霉菌毒素在Caco-2细胞模型中的跨膜转运率,降低幅度依次为37.14%、43.21%、45.78%、25.90%、25.50%和28.69%（P<0.05）。
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