细胞周期调控基因与POLD1基因转录活性的相关性研究

论文摘要

DNA复制调控是细胞周期调控的一个核心事件。在DNA合成过程中,细胞周期通过Cyclin、CDK、CKI及其它相关蛋白对DNA复制复合体进行复杂的活性调控,因而保证每个细胞周期中DNA只能精确地复制一次。此外,细胞周期还控制着复制体相关基因的表达。DNA合成时,DNA聚合酶δ（polδ）与PCNA、RFC构成复合体,进而完成导前导链与后滞链的延伸。真核细胞polδ由4个亚基组成,POLD1基因编码了催化亚基,其mRNA及蛋白水平在G1/S期达到高峰,但是至今尚不清楚细胞周期通过何种通路调控POLD1启动子活性。本研究运用细胞周期同步化及荧光素酶报告基因测定了人乳腺癌MCF7细胞中POLD1启动子在细胞周期不同时相的活性。结果显示启动子活性随着细胞周期进程而变化,在早S期最高。瞬时共转染实验发现,随着E2F1的积累,POLD1启动子活性逐渐升高,表现出剂量依赖效应。E2F1最大能将POLD1启动子活性提高到对照组的2.98倍。运用染色体免疫共沉淀（ChIP）技术证明E2F1能够与POLD1启动子结合。为进一步确定调控POLD1表达的细胞周期相关因子,应用质粒pXJ41-neo、pEGFP-p53、pXJ41-p21、pXJ41-as-CDK2、pXJ41-as-CyclinE、pXJ41-as-CDK4及pXJ41-as-Cyclin D1分别转染MCF7细胞,分别筛选得到稳定细胞系。结果表明增强p53或p21的表达,抑制CDK2或Cyclin E的表达都能抑制POLD1启动子活性;而抑制CDK4或Cyclin D1的表达对启动子活性没有明显影响。随着CDK2或Cyclin E表达量的降低,POLD1启动子活性逐渐降低,表现出剂量依赖效应。抑制CDK2的表达能将POLD1启动子活性降低到对照组的50%左右,而抑制Cyclin E的表达能降低到30%。此外,对POLD1启动子的抑制作用还表现出时间依赖效应,一般在转染24小时后才能表现出较强的抑制,而转染48小时后的抑制最强。用pEGFP-p53重组质粒瞬时转染MCF7细胞,RT-PCR结果显示由于p53表达增强,POLD1基因mRNA水平降低。染色体免疫共沉淀和荧光素酶实验证明p53在细胞内直接结合POLD1启动子而抑制其活性,且这种抑制具有时间依赖效应和剂量依赖效应。间接免疫荧光和荧光定位实验均显示p53在G1期进入细胞核而在S期和G2期则被转运至细胞质。但是荧光素酶实验显示p53在细胞周期各时相都能抑制POLD1启动子活性,表现出细胞周期非依赖性特点。本研究还发现,在p21表达增强的细胞中,POLD1 mRNA及蛋白水平都有所下降。p21高表达后能抑制POLD1启动子活性,且这种抑制具有剂量依赖效应,抑制最强时,启动子活性只相当于对照组的27%。同时,这种抑制也具有时间依赖效应,在转染后36小时后才能达到最大抑制。p21还可以通过影响E2F1的活性而消除E2F1对POLD1启动子的促进作用。利用p21的截取突变体和点突变体发现p21对POLD1启动子的抑制作用不依赖于Cyclin/CDK复合体或PCNA。利用一系列POLD1启动子突变体发现,p21对POLD1启动子的抑制是通过位于启动子+29～+33和+44～+48位置的CDE/CHR元件实现的。突变部分或全部的该元件后,p21几乎不能抑制启动子活性。这些结果说明p21能够以较为复杂的方式抑制POLD1启动子活性。本研究首次系统探讨了细胞周期重要调控因子对POLD1基因启动子活性的调控作用,确定出E2F1、CDK2、Cyclin E、p53和p21对POLD1启动子活性的影响及作用方式。这些结果有助于理解细胞周期进程中DNA复制的调控机理。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 一 DNA 聚合酶δ
• 1 polδ的组成及功能
• 1.1 polδ是多亚基组成的复合体
• 1.2 polδ的功能
• 2 POLD1 基因及其启动子结构研究
• 2.1 POLD1 基因结构
• 2.2 POLD1 基因启动子的克隆及功能研究
• 二 哺乳动物细胞 DNA 复制体及 DNA 复制机制
• 1 哺乳动物DNA 复制体
• 1.1 DNA 复制体的组成
• 1.2 DNA 复制体核心蛋白的结构及功能
• 1.3 polδ与PCNA 的相互作用
• 2 哺乳动物DNA 复制模型
• 三 细胞周期依赖的 DNA 复制体活性调控
• 1 DNA 复制过程中的CYCLIN/CDK 复合体转换及其对DNA 复制体的影响
• 2 CYCLIN/CDK 复合体对DNA 复制体的磷酸化
• 3 其它细胞周期相关蛋白对DNA 复制体的调控作用
• 四 POLδ的细胞周期依赖性调控是 DNA 复制体研究的重要内容
• 第二部分 材料与方法
• 一 实验材料
• 1 菌株
• 2 细胞株
• 3 质粒
• 二 主要试剂
• 1 酶类
• 2 抗体
• 3 试剂盒和其他主要生化试剂
• 三 仪器设备
• 四 实验方法
• 1 质粒的构建
• 1.1 G1 期周期调控因子真核表达载体的构建
• 1.2 POLD1 启动子各种突变体的构建
• 1.3 p21 各种突变体质粒的构建及鉴定
• 2 细胞转染及稳定表达细胞株的筛选
• 2.1 细胞培养
• 2.2 细胞转染
• 2.3 G418 筛选转染细胞系
• 3 启动子活性的测定
• 3.1 细胞转染
• 3.2 细胞提取物的制备
• 3.3 β-半乳糖苷酶活性的检测
• 3.4 荧光素酶活性的检测
• 4 蛋白表达量的检测
• 4.1 蛋白的提取
• 4.2 蛋白浓度的测定（Bradford 法）
• 4.3 Western blotting 检测蛋白的表达量
• 5 RNA 的提取及RT-PCR 检测MRNA 的表达
• 5.1 RNA 的提取
• 5.2 RT-PCR 检测mRNA 的表达
• 6 染色体免疫共沉淀（CHROMATIN IMMUNOPRECIPITATION，CHIP）
• 7 细胞周期分析
• 7.1 TdR 双阻断法进行细胞周期同步化
• 7.2 流式细胞光度术（FCM）分析细胞周期
• 8 细胞间接免疫荧光（IF）及荧光定位实验
• 8.1 细胞间接免疫荧光
• 8.2 p53 荧光定位实验
• 第三部分 实验结果
• 一 POLD1 启动子在细胞周期不同时相的活性分析
• 二 E2F1 对 POLD1 启动子活性的促进作用
• 1 E2F1 对POLD1 启动子活性的促进
• 1.1 E2F1 真核表达载体的构建
• 1.2 E2F1 能够促进POLD1 启动子活性
• 2 E2F1 与POLD1 启动子在细胞内的结合
• 三 G1 期周期调控因子对 POLD1 基因启动子活性的调控
• 1 真核表达载体的构建及鉴定
• 2 G1 期周期调控因子对POLD1 启动子活性的影响
• 3 CDK2 对POLD1 启动子活性的调控
• 4 CYCLIN E 对POLD1 启动子活性的调控
• 四 P53 对 POLD1 基因的表达调控作用
• 1 P53 对POLD1 基因转录的抑制
• 2 P53 对POLD1 启动子活性的抑制
• 2.1 p53 对POLD1 启动子的抑制具有剂量依赖效应
• 2.2 p53 能够持续抑制POLD1 启动子活性
• 3 P53 在细胞内与POLD1 启动子的结合
• 4 细胞周期对P53 核转运的调控
• 4.1 内源性表达的p53 在MCF7 细胞中的定位受到细胞周期的严格调控
• 4.2 EGFP-p53 融合蛋白在MCF7 细胞中的核转运也受到细胞周期的严格调控
• 5 P53 对POLD1 启动子活性的细胞周期非依赖性抑制
• 五 P21 对 POLD1 基因表达的抑制作用
• 1 P21 高表达对POLD1 基因MRNA 水平及蛋白表达的影响
• 1.1 p21 对p125 蛋白表达水平的影响
• 1.2 p21 能够抑制POLD1 mRNA 表达
• 2 P21 对PODL1 启动子活性的抑制
• 2.1 p21 抑制POLD1 启动子具有剂量依赖效应
• 2.2 p21 在一定时间内能够持续抑制POLD1 启动子
• 3 P21 能够影响E2F1 对POLD1 启动子的激活作用但不影响E2F1 的表达
• 3.1 p21 能够影响E2F1 对POLD1 启动子的激活作用
• 3.2 p21 的高表达不影响E2F1 的表达
• 4 P21 各种突变体对POLD1 启动子活性的影响
• 4.1 p21 截短突变对POLD1 启动子的影响
• 4.2 p21 点突变对POLD1 启动子的抑制作用
• 5 P21 的抑制作用与POLD1 启动子CDE/CHR 元件的相关性
• 5.1 POLD1 启动子3’端2306p 区域内可能存在受p21 抑制的调控元件
• 5.2 POLD1 启动子3’端截取突变体对p21 抑制的敏感性分析
• 5.3 p21 可以通过CDE/CHR 元件抑制POLD1 启动子活性
• 第四部分 讨论
• 一 POLD1 启动子活性受到细胞周期的调控
• 二 E2F1 在细胞内与POLD1 启动子结合并促进其活性
• 三 CYCLIN E/CDK2 复合体参与了POLD1 的表达调控
• 四 P53 在细胞内与POLD1 启动子，并以细胞周期非依赖方式抑制其活性
• 1 P53 的高表达能够抑制POLD1 基因MRNA 转录
• 2 首次证明P53 在细胞内能够直接与POLD1 启动子结合
• 3 首次在细胞周期进程中关注P53 对POLD1 启动子的调控
• 3.1 证明了p53 的亚细胞定位在MCF7 细胞中受到细胞周期的严格调控
• 3.2 p53 对POLD1 启动子的抑制作用表现出细胞周期非依赖特点
• 五 P21 参与了POLD1 基因的表达调控
• 1 首次发现P21 能够抑制POLD1 基因的表达
• 2 P21 能影响E2F1 对POLD1 启动子的促进作用
• 3 P21 对POLD1 的抑制机制较为复杂
• 3.1 p21 可能直接与E2F1 结合而抑制POLD1 启动子
• 3.2 p21 通过其它转录因子抑制POLD1 启动子活性
• 4 P21 通过CDE/CHR 元件影响POLD1 启动子活性
• 六 POLD1 基因的细胞周期表达调控网络
• 参考文献
• 致谢
• 缩略语表
• 个人简历
• 附录：相关质粒的测序结果