论文摘要
法氏囊（bursa of Fabricus, BF）是禽类独有的中枢免疫器官,其功能类似与哺乳动物中的骨髓。三肽囊素作为BF组织中分离唯一已知的活性分子,无种属特异性,不仅对禽类具有免疫调节功能,而且对哺乳动物及人类淋巴细胞也具有明显的免疫学及生理学活性。其具有独特组成结构,氨基酸组成顺序为Lys:His:Gly:NH2,其中Lys:His:Gly:NH2为1：0.9：1：0.8。目前,对于囊素免疫学功能的研究主要集中在禽类促进体液免疫方面,至于其在哺乳细胞中的免疫调节机制,还尚需深入研究,有关囊素发挥作用的具体机制尚不清楚,囊素是否与其它多肽一样存在膜受体以及是否通过受体介导而发挥生物学效应还未可知。这些都极大的限制了囊素作为免疫活性分子在临床的广泛应用前景。赵明军等利用噬菌体展示技术筛选与BS单克隆抗体特异性结合肽,发现“TXNL”肽是与BS单克隆抗体特异性结合的保守序列。竞争ELISA表明,该“TXNL”肽在一定程度上可以竞争性抑制BS与BS单克隆抗体结合。生物活性试验表明,该“TXNL”肽与BS也具有类似的生物学作用。提示,对囊素模拟肽的研究可阔宽囊素的应用前景,同时对于囊素免疫调节机制的研究具有积极意义。本研究,基于囊素和模拟肽分子设计几种囊素样肽,通过基因工程串连表达后,在小鼠模型中,研究其作为免疫佐剂在哺乳动物中的对乙脑亚单位疫苗和禽流感灭活疫苗的免疫调节作用,通过其对小鼠细胞免疫水平、体液免疫水平以及免疫保护力的检测,评价其作为新型多肽免疫佐剂的潜能。同时以囊素分子为靶标,利用噬菌体展示技术,研究与之相互作用蛋白,为揭示囊素作用机制和进一步的囊素生物学功能研究提供新的线索。研究主要从以下几个方面展开：1囊素样肽基因的设计及在大肠杆菌中的表达按大肠杆菌惯用密码子通过SOE-PCR方法合成三种囊素样肽基因,108 bp的（K-H-G）10基因由10拷贝的BS（K-H-G）串联,上下游分别带有EcoRI和Sall site位点。116 bp的（T-X-N-L）8基因由8拷贝的BS模拟肽（T-X-N-L）串联,上下游分别带有EcoRI和HindⅢ位点。125bp的（T-X-N-L-K-H-G） 5基因由5拷贝的（T-X-N-L-K-H-G）串联,经测序证明序列正确后,克隆至pET32a载体中,三种重组表达载体在大肠杆菌BL21中诱导表达,经SDS-PAGE电泳证实,三种融合蛋白主要以可溶形式存在,分别为24.9、25.2和25.5 KDa大小。融合蛋白经Ni2-NTA亲合柱纯化,Western blot结果表明三种融合蛋白与bursin有着相似的免疫反应性。通过基因工程的方法得到囊素样肽的表达产物,为后续研究奠定了基础。2囊素样肽对乙脑亚单位疫苗的免疫效果影响为探讨囊素样肽的免疫调节作用,在小鼠模型中评价其对乙脑亚单位疫苗的免疫效果影响。通过检测保护性抗体JEV-E滴度、抗体亚型（IgG1和IgG2a）、淋巴细胞增殖、INF-γ和IL-4细胞因子的表达水平、T细胞亚型发现。使用三种囊素样肽能都明显提高JEV-BD免疫小鼠的特异性免疫反应。IgG2a和细胞因子1NF-γ水平表明JEV-BD主要刺激Thl型免疫反应。而囊素样肽能明显增加小鼠的Th2反应。尤其是（T-X-N-L-K-H-G）5肽能平衡2种类型的免疫反应。实验结果预示,囊素样肽作为佐剂能明显增强JEV亚单位疫苗免疫小鼠的免疫反应,有望能成为一个有潜力的疫苗佐剂。3囊素样肽有效提高禽流感H9N2灭活疫苗对小鼠的免疫保护为进一步研究囊素样肽的免疫调节机制,4-6周龄小鼠随机分为6组,每组30只。用不同剂量合成的囊素样肽T-P-N-L-K-H-G与禽流感H9N2灭活病毒（W1V）混合后分别以肌肉接种的方式给小鼠进行3次免疫,同时设两组对照组小鼠,分别免疫PBS和常规灭活疫苗。最后一次免疫后1周攻毒。然后通过测定HI血清效价、HA抗体和抗体亚型、Thl和Th2类型细胞因子分泌水平、脾T细胞亚群和NK细胞变化、细胞特异性CTL活性以及攻毒保护力来评价囊素样肽作为分子佐剂的免疫调节作用。结果显示,肽佐剂能平衡IgG1和IgG2a的分泌水平。单独WIV抗原免疫主要诱导小鼠Thl类型细胞因子的产生,而肽佐剂能明显提高WIV抗原免疫后小鼠两种类型细胞因子的分泌水平,但对IL-10分泌水平没有促进作用。肽佐剂能有效促进WIV抗原免疫的小鼠脾淋巴细胞中T细胞CD4+和CD8+亚群的分化。对小鼠脾淋巴细胞中NK细胞的增殖也具有调节作用。中、低剂量肽佐剂联合WIV抗原免疫后,可以诱发小鼠产生较好的针对H9N2病毒的特异性CTL反应,其杀伤率明显高于单独WIV抗原免疫组和H9N2疫苗组。小鼠攻毒后肺脏病毒含量检测显示,囊素样肽有助于WIV抗原免疫后小鼠肺脏病毒的清除。以上结果证实合成的囊素样肽通过介导细胞和体液免疫反应显著提高禽流感H9N2灭活病毒对小鼠的免疫保护。但囊素样肽免疫调节作用不存在剂量依赖关系,高剂量对免疫作用有一定的抑制。对囊素样肽的作用剂量关系还需进一步研究。4小鼠杂交瘤细胞膜Bursin受体的表达囊素能有效促杂交瘤细胞抗体的分泌,因而研究杂瘤细胞膜是否具有囊素受体的表达,对于全面阐清囊素促杂交瘤细胞抗体分泌的信号传导通路尤为重要。采用荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪分析的方法,检测囊素与杂交瘤细胞膜相结合的情况以及二者的结合特性。实验结果证实,BS能特异结合在杂交瘤细胞膜上,与杂交瘤细胞的结合率不随有剂量效应关系且有饱和趋向性。加入FITC-BS在400ug/m、600ug/ml浓度时结合率达到最高。结合率分别为51.0%、50.6%。二者的结合率无显著差异（P<0.05）。而当加入人工合成的BS,在高于400ug/ml浓度时能明显抑制FITC-BS与杂交瘤细胞的结合,抑制率呈显著差异（P<0.05）。表明,BS与杂交瘤细胞的结合具有可逆性。因而,我们初步推测杂交瘤细胞膜上存在着特异的结合蛋白,该蛋白很可能是囊素的受体,参与了囊素促杂交瘤细胞抗体分泌过程。5囊素结合肽的筛选及活性鉴定以囊素分子作为靶标,对噬菌体随机12肽库进行亲和筛选,经过4轮筛选,随机挑取20个克隆,ELISA法鉴定其亲和性,结果筛选得10个能与囊素较强结合的噬菌体克隆,竞争抑制试验证实其中2个克隆能竞争人工合成的多肽BS与囊素的结合。对阳性克隆进行测序并进行序列分析,推导的氨基酸序列分别为ACTKHLCLLQPL; MSCNDTLCLLPN;其保守序列为LCLL。体外实验表明,2个人工合成的结合肽都能在一定程度上抑制囊素与杂交瘤细胞的特异性结合,这进一步证实杂交瘤细胞有囊素结合的受体,同时也提示,“LCLL”保守基序很可能是囊素细胞膜受体结合位点。6 B淋巴细胞中囊素结合蛋白的筛选B淋巴细胞是囊素相当重要的作用靶细胞,为研究囊素在B淋巴细胞中的作用机制及相互作用蛋白,利用噬菌体表面展示技术,以纯化的TRX-BS融合蛋白为靶蛋白,对鸡B细胞噬菌体T7 cDNA文库进行生物筛选,噬菌体经过3轮筛选后出现明显生物富集,随机挑选第三轮筛选的10个噬斑裂解液做PCR扩增,将其PCR产物序列测定后进行同源搜索,初步确定了2个与bursin结合的蛋白,为3-羟基异丁基-辅酶A水解酶（3-hydroxyisobutyryl-Coenzyme A hydrolase）和含EGF腓素样细胞外基质蛋白1（similar to EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1, EFEMP1）。为进一步研究bursin勺生物学功能提供了新的思路。