养殖大菱鲆病原菌的分离鉴定、组织病理学及免疫组织化学

论文摘要

大菱鲆是近年来我国引进国外优质水产养殖品种中最成功的一种,它抗病力较强,性少动,容易接受配合饲料,饲料系数低,生长迅速,经济价值高,深受养殖户的喜爱。但是,随着鱼的本土化以及养殖方式的缺陷,逐渐出现了各种疾病,其中细菌性传染病最为常见。我们在2007年1月份和4月份的几批病鱼中分离得到的三株致病菌进行了鉴定。这三株致病菌分别为杀鲑气单胞菌无色亚种(Aeromonas salmonicida subsp. achromogenes)(编号db14)、牙鲆肠弧菌(Vibrio ichthyoenteri)(编号da3)和腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)(编号db6)。菌株db14从患病大菱鲆肝脏中分离出,人工感染试验证实db14对大菱鲆及模式动物斑马鱼都具有很强的致病性,其半数致死量分别为1×105cfu/尾(25g)和1.3×102cfu/尾。该病原菌革兰氏染色阴性,菌体呈杆状。综合该菌在形态、生理生化特征及16S rDNA同源性等方面的结果,确认db14为杀鲑气单胞菌无色亚种。该菌株对复达欣,菌必治、丁胺卡那霉素和氯霉素等抗生素敏感,对多种抗生素有完全的抗性。受db14感染发病的大菱鲆肝脏中细胞组织水肿,细胞内沉积大量蛋白类物质。肾脏中组织细胞坏死,肾小管发生水肿。小肠绒毛中的固有层萎缩。菌株da3从患病大菱鲆胆囊中分离出,人工感染试验证实da3对大菱鲆有较强的致病性,其对25g重大菱鲆的半数致死量为2×106 cfu/尾。该病原菌革兰氏染色阴性,菌体呈杆状。综合该菌在形态、生理生化特征及16S rDNA同源性等方面的结果,确认da3为牙鲆肠弧菌(Vibrio ichthyoenteri)。受da3感染发病的大菱鲆病鱼肝脏中可见肝细胞萎缩变形,染色变深,嗜碱性。病鱼肾脏中可见肾组织细胞受损,嗜碱性,细胞核膨胀,肾小球和肾小管萎缩。小肠杯形细胞肿胀,固有层萎缩。脑组织中出现大型病理性空泡。肝、肾和脾的组织中红细胞减少。菌株db6从患病大菱鲆肾脏中分离出,人工感染试验证实db6有较强的致病性。该病原菌革兰氏染色阴性,菌体呈杆状。综合该菌在形态、生理生化特征及16S rDNA同源性等方面的结果,确认为腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)。该菌是一种水生菌,但作为病原体多见报道在人体中发现,而作为鱼类病原菌不常见。该菌株对氟哌酸敏感。受感染发病的大菱鲆肝细胞和肾间质细胞破碎,肠上皮溃疡。以上三株菌都是首次作为大菱鲆的病原菌出现,反映了当前大菱鲆养殖业正在面临日益增多的病原菌的威胁。对于病原菌在鱼体中的定位,国内相关的研究并不多。我们运用间接免疫抗体技术和组织革兰氏染色法来确定迟缓爱德华氏菌在其感染致病的大菱鲆体内的分布,发现肝、肾和脾等器官的组织结构发生了显著的变化,在这几种器官中也发现了少量菌体,在这些器官外面的结缔组织中发现了大量菌体。我们发现它在不同的组织中有不同的分布特点:在器官内部,菌体呈菌落状态存在于巨噬细胞中,在肠腔粘膜和内脏器官表面的结缔组织的细胞间质中,菌体可单个,两三个存在,也可呈较大的菌落状态存在。发生病变的组织中菌体并不多,说明该菌可能通过外毒素损伤组织细胞。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 我国的大菱鲆养殖概况
• 2 养殖大菱鲆的病害现状
• 2.1 危害大菱鲆的病原有寄生虫，细菌和病毒
• 2.1.1 寄生虫病
• 2.1.2 病毒性病原
• 2.1.3 细菌性病原
• 2.2 鱼类病原菌的鉴定方法概述
• 2.2.1 16Sr DNA 序列比对
• 2.2.2 微量多项试验鉴定系统
• 2.2.3 快速、自动化微生物检测仪器和设备
• 3 杀鲑气单胞菌与大菱鲆
• 4 牙鲆肠弧菌与大菱鲆
• 5 腐败希瓦氏菌与大菱鲆
• 6 迟缓爱德华氏菌与大菱鲆
• 6.1 迟缓爱德华菌的基本情况
• 6.2 迟缓爱德华菌的防治
• 7 鱼类病理学的观察方法
• 7.1 大体观察或称肉眼观察
• 7.2 组织和细胞学观察或称镜下观察
• 7.3 超微结构观察或称电镜观察
• 7.4 其他方法
• 8 组织切片技术在大菱鲆病害研究中的应用
• 8.1 免疫组织化学技术
• 8.1.1 免疫荧光组织化学技术
• 8.1.2 免疫酶组织化学技术
• 8.2 亲和细胞化学技术
• 9 常见的组织细胞病变原因和表现
• 9.1 细胞损伤的原因
• 9.1.1 缺氧
• 9.1.2 物理因素
• 9.1.3 化学因素
• 9.1.4 生物因素
• 9.1.5 免疫反应
• 9.1.6 遗传因素
• 9.2 常见细胞损伤的类型
• 9.2.1 可复性损伤
• 9.2.2 不可复性损伤即坏死
• 第二章 养殖大菱鲆病原菌—杀鲑气单胞菌无色亚种的分离鉴定及组织病理学研究
• 摘要
• 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 病原菌的分离
• 1.3 各器官组织切片检测
• 1.4 人工感染试验
• 1.5 病原菌分类、鉴定
• 1.5.1 菌体染色
• 1.5.2 生理生化反应检测
• 1.5.3 细菌16S rDNA 序列测定
• 1.6 病原菌的药敏试验
• 2 实验结果
• 2.1 病原菌的分离及致病性
• 2.2 病原菌的鉴定
• 2.2.1 病原菌形态特征
• 2.2.2 生理生化鉴定的结果
• 2.2.3 病原菌的16S rDNA 序列
• 2.4 化学治疗剂对病原菌的抑制作用
• 2.5 组织病理变化
• 3 讨论
• 第三章 养殖大菱鲆中牙鲆肠弧菌的分离鉴定及组织病理学研究
• 摘要
• 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 分离病原菌
• 1.2 各器官组织切片检测
• 1.3 人工感染试验
• 1.4 病原菌鉴定
• 1.4.1 细菌染色
• 1.4.2 细菌16S rDNA 序列测定
• 1.4.3 生理生化反应检测
• 2 结果
• 2.1 病原菌的分离及致病性
• 2.2 病原菌的鉴定
• 2.2.1 染色的结果
• 2.2.2 病原菌16S rDNA 的序列比较
• 2.2.3 组织切片的结果
• 3 讨论
• 第四章 养殖大菱鲆中腐败希瓦氏菌的分离鉴定及组织病理学研究
• 摘要
• 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 病原菌的分离
• 1.3 人工感染试验
• 1.4 病原菌分类、鉴定
• 1.4.1 菌体染色
• 1.4.2 生理生化反应检测
• 1.4.3 细菌16S rDNA 序列测定
• 1.5 病原菌的药敏试验
• 1.6 组织切片的制作
• 2 结果
• 2.1 病原菌的分离及致病性
• 2.2 病原菌的鉴定
• 2.2.1 病原菌形态特征
• 2.2.2 生理生化鉴定结果
• 2.2.3 病原菌的16S rDNA 序列
• 2.3 病原菌对药物的敏感性
• 2.4 病鱼的组织病理学
• 3 讨论
• 第五章 感染迟缓爱德华氏菌的大菱鲆组织病理学及间接荧光染色法组织定位
• 摘要
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 细菌的分离
• 1.2 菌体灭活疫苗的制备
• 1.3 组织切片和染色
• 2 结果
• 2.1 组织的病理变化
• 2.2 内脏器官中的细菌菌体
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 撰写和发表的论文
• 致谢