微生物提取物诱导马铃薯抗晚疫病及机理的研究

论文摘要

马铃薯（Solanum tuberosum L.）是世界四大粮食作物之一,我国是世界最大的马铃薯生产基地之一。马铃薯在世界粮食生产中占有非常重要的地位,联合国将2008年命名为“国际马铃薯年”。马铃薯生产的发展一直受到一些真菌病害的严重威胁,尤其是马铃薯晚疫病,造成马铃薯的严重减产甚至绝产。人工免疫诱导植物抗病技术是近十几年来发展起来的技术,具有安全、高效、广谱、持久的特点,可以从根本上改善和提高品种的抗性,从而有可能开辟一条新的植物广谱抗病的方法。尤其是近年来人们已陆续报道了植物提取物、化学物质、物理因子、真菌及细菌提取物对马铃薯晚疫病的诱导抗性。但利用放线菌来源提取物和复配型提取物诱导马铃薯抗晚疫病及机理的报道却不多见。本研究主要对放线菌来源提取物以及将两种微生物源提取物混配后诱导马铃薯块茎抗晚疫病的作用及其机理进行了初步研究。为从丰富的微生物资源尤其是从放线菌中筛选优良的诱导马铃薯抗晚疫病的激发子及利用复配型提高诱抗效果方面的研究打下了基础,并对进一步了解植物诱导产生抗病性机理有一定的参考价值。本实验取得的主要结果如下：1、分别将32种微生物的发酵液（F-0）以及其中真菌和放线菌的胞内提取物（F-1）、胞壁提取物（F-2）单独或复配后作为激发子,诱导处理马铃薯块茎切片,筛选出9种单一型（A5295 F-0、A32912 F-0、A32910b F-0、MK F-0, M102 F-1、Wf3 F-1以及M102F-2、F32 F-2和Wf3 F-2）和5种复配型（A5295 F-0+F32 F-0、A5295 F-0+A32910b F-0、Wf3 F-2+F32 F-2、F32 F-2+ M102 F-2、F32 F-0+A32910b F-0）微生物源激发子,诱抗效果均达到50%以上。其中MK F-0、A5295 F-0和A32910b F-0的诱抗效果分别达到60.42%、63.97%和56.25%。复合型微生物源激发子诱导抗病效果优于其单一型,其中MK F-0+A5295 F-0的诱抗效果最好,达到66.67%,。2、利用硫酸铵沉淀和乙醇沉淀法对诱抗效果显著的两种发酵液型激发子（真菌MKF-0和放线菌A32910bF-0）中的有效诱抗物质进行了初步分析,发现A32910b F-0和MK F-0中的有效诱抗物质相似,均存在于发酵液的硫酸铵沉淀组分（A组分）和硫酸铵沉淀后再经乙醇沉淀所得组分（B组分）中。这些具有诱导马铃薯块茎抗晚疫病的活性物质主要是一些分子量大于8000-10000D物质,推测为蛋白质、多糖、脂质等大分子物质。3、明确了经过诱导处理的马铃薯块茎切片中与抗病性相关的酶（PPO、POD、PAL）活性变化情况,发现诱导处理后马铃薯块茎中POD、PAL、PPO活性均明显高于对照,经A5295发酵液处理后第5d时3种酶活性分别是对照的250.40%、275.14%和27.88%,且在抗性表现出之前就迅速增加达到峰值。4、分析了诱导处理后块茎切片中的可溶性蛋白变化。诱导处理后块茎中可溶性蛋白含量明显增多,比对照增加41.53%,并有一些新蛋白产生。这些新生成的蛋白质分子量均在100KD以下,其中3种分子量在40KD以下,他们可能是PR蛋白,因为新蛋白的产生伴随有抗性相关酶活性的显著增加,所以推测它们具有抗性相关酶活性。可见,利用放线菌来源提取物作为激发子诱导马铃薯抗晚疫病具有非常大的开发潜力。有些微生物提取物复配后诱抗效果获得了明显提高,复配型微生物提取物在诱导马铃薯抗抗晚疫病的应用中也具有广阔的前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1 马铃薯和晚疫病
• 2 马铃薯晚疫病的防治
• 2.1 抗病育种
• 2.2 化学防治
• 2.3 生物防治
• 3 植物诱导抗病性
• 3.1 植物诱导抗病性的定义
• 3.2 植物诱导抗病性的特征
• 4 植物诱导抗病性的因子
• 4.1 生物源激发子
• 4.1.1 微生物源激发子
• 4.1.2 植物源激发子
• 4.2 非生物源激发子
• 4.2.1 化学物质
• 4.2.2 物理因子
• 5 诱导抗性机制研究进展
• 5.1 生理生化机制
• 5.1.1 植物保卫素的产生和积累
• 5.1.2 植物防御酶系的变化
• 5.1.3 活性氧迸发（OXB）
• 5.1.4 PR蛋白的生成
• 5.2 组织病理学机制
• 5.3 分子生物学机制
• 6 诱导马铃薯抗晚疫病研究进展
• 6.1 生物源激发子诱导马铃薯抗晚疫病
• 6.2 非生物源激发子诱导马铃薯抗晚疫病
• 7 本研究的目的和意义
• 第2章 诱导马铃薯抗晚疫病的微生物源激发子的筛选
• 1 实验材料
• 1.1 病原真菌
• 1.2 供试菌种
• 1.3 马铃薯
• 1.4 培养基
• 1.5 试剂
• 1.6 实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 激发子的制备
• 2.1.1 真菌类激发子的制备
• 2.1.2 放线菌类激发子的制备
• 2.1.3 细菌类激发子的制备
• 2.2 马铃薯块茎诱导抗病性实验
• 2.2.1 马铃薯块茎的准备
• 2.2.2 块茎诱导实验
• 2.2.3 挑战接种
• 2.2.4 病情指数及诱抗效果的计算
• 3 实验结果
• 3.1 发酵液筛选结果
• 3.2 胞内提取物的筛选
• 3.3 胞壁提取物的筛选
• 4 讨论
• 第3章 激发子中有效诱抗物质的初步分离
• 1 实验材料
• 1.1 菌种
• 1.2 实验仪器
• 1.3 实验试剂
• 2 试验方法
• 2.1 激发子的制备
• 2.2 有效诱抗物质的获得
• 2.3 马铃薯块茎诱导实验
• 3 实验结果
• 3.1 MK F-0中的有效诱抗物质
• 3.2 A32910b F-0的有效诱抗物质
• 4 讨论
• 第4章 复配型微生物源激发子的筛选
• 1 实验材料和仪器
• 2 试验方法
• 2.1 复合型诱导液的制备
• 2.1.1 两种微生物源激发子的复配
• 2.1.2 化学物质水杨酸与微生物源激发子的复配
• 2.2 复配型激发子的块茎诱导实验
• 3 实验结果
• 3.1 两种微生物源激发子的复配诱抗实验
• 3.2 微生物源激发子与水杨酸复配
• 4 讨论
• 第5章 微生物源激发子对马铃薯块茎中防御酶系活性和可溶性蛋白质含量的影响
• 1 实验材料
• 1.1 菌种和马铃薯
• 1.2 试剂
• 1.2.1 酶活性测定试剂
• 1.2.2 可溶性蛋白提取液
• 1.2.3 电泳试剂
• 1.2.4 其他试剂
• 1.3 实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 抗性相关酶活性的测定
• 2.1.1 块茎的诱导处理及取样
• 2.1.2 酶的提取
• 2.1.3 酶活的测定
• 2.2 马铃薯块茎中可溶性蛋白的变化
• 2.2.1 马铃薯块茎的诱导处理
• 2.2.2 马铃薯块茎可溶性蛋白的提取
• 2.2.3 蛋白质含量的测定
• 2.2.4 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 3 实验结果
• 3.1 马铃薯块茎中抗性相关酶活性的变化
• 3.1.1 马铃薯块茎中POD酶活性的变化情况
• 3.1.2 马铃薯块茎中PAL酶活性的变化情况
• 3.1.3 马铃薯块茎中POD酶活性的变化情况
• 3.2 马铃薯块茎中可溶性蛋白的变化
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录——硕士期间发表论文
• 致谢