粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子在巴斯德毕赤酵母中的表达研究

论文摘要

目的:通过具有创新性的基因工程手段获得粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因,并将其按照酵母偏爱密码子优化,消除自然序列中存在的发夹结构,然后导入巴斯德毕赤酵母表达系统,使其诱导表达,获得具有生物活性且具有一定经济价值的GM-CSF。方法:首先从人体基因组克隆得到hGM-CSF全基因,然后通过采用引物5′端加长法克隆了含127个编码氨基酸的hGM-CSF,在引物克隆过程中对该基因做了局部的密码子优化。最后通过高保真Taq酶扩增和EcoRI单酶切的方法将该基因整合进毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,通过电击转化和甲醇诱导筛选,最终获得一株摇瓶水平粗蛋白表达量达3.89 g/1的转化子。结果:PCR、SDS-PAGE与westeran blotting免疫杂交证实hGM-CSF活性正常。SDS-PAGE电泳发现所表达的hGM-CSF均发生了糖基化,通过N-糖苷酶F去糖基化也证实了这点。结论:本研究成功构建了可高效表达、有效分泌hGM-CSF的重组毕赤酵母工程菌,提供了一条产量高、分离纯化简便,可低成本大规模生产hGM-CSF的新途径。为实现hGM-CSF生产的产业化奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 第二章 结果
• 2.1 HGM-CSF编码基因的获得
• 2.2 构建酵母分泌型表达载体
• 2.3 重组分泌表达载体转化毕赤酵母及重组酵母的筛选
• 2.4 多拷贝重组酵母的筛选
• 2.5 酵母重组子的PCR检测
• 2.6 可分泌表达GM-CSF重组酵母的初筛
• 2.7 重组酵母分泌表达产物的WESTERN BLOTTING分析
• 2.8 重组酵母分泌表达产物的去糖基化分析
• 2.9 重组酵母分泌表达产物的活性检测
• 第三章 讨论
• 第四章 结论
• 第五章 参考文献
• 第六章 综述
• 6.1 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子研究进展
• 6.2 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果
• 致谢