Has-mir-129调控SN12-PM6肾癌细胞生物学特性的实验研究

论文摘要

肾癌是起源于肾小管上皮细胞的一种常见肾脏恶性肿瘤，占成人全部恶性肿瘤的2-3％，占肾脏原发性恶性肿瘤的85-90％，发病率仅次于膀胱肿瘤。以往的报道显示肾癌患者确诊时，有30％已合并有远处转移，而其中合并肺转移的患者占很大比率。近年来，近10年来随着影像技术的进步，特别是B超的广泛普及和CT的升级换代，极大促进了肾癌诊疗水平的提高，从而导致肾癌发现比率明显增加。多年来的研究已经证实，肾癌对化疗、放疗、激素治疗效果差。免疫治疗目前被认为是最有价值的治疗手段，但其有效率也在35％以下。肾癌的治疗缺乏一个非常有效的治疗方法，而目前已有的研究显示miRNAs有可能会成为一种潜在的治疗肿瘤的新途径。miRNAs是一类分布十分广泛的大约22个核苷酸大小的内源性非编码RNA，通过控制靶miRNAs达到调控靶基因的表达或翻译。miRNAs在动物、植物、病毒中广泛存在，其序列高度保守。miRNAs在细胞的增殖、分化及凋亡等方面有重要的作用，并对真核生物基因的表达有调控作用。miRNAs对肿瘤的调控作用主要体现在两个方面：可以通过调控原癌基因抑制肿瘤从而起到抑癌基因的作用；另外也可以调控抑癌基因起到癌基因作用。目前研究发现，miRNAs在不同的肿瘤组织中表达水平不同，有些miRNAs在肿瘤组织的表达水平明显低于正常组织，而另外一些肿瘤组织中miRNAs则明显的上调，这些表达异常的miRNAs可能与肿瘤的发生有着密切的关系。我们将has-mir-129通过脂质体介导的方法转染肾癌细胞株，观察其在体外对肾癌细胞的影响。建立肾癌肺转移动物模型，并观察has-mir-129对动物模型肿瘤的形成及肺转移的影响，本研究分为三个部分，现将研究结果报告如下：第一部分has-mir-129转染SN12-PM6肾癌细胞株对其生长影响的实验研究本部分主要研究has-mir-129对肾癌SN12-PM6细胞侵袭和增值能力的影响。我们经过质粒的扩增、抽提等步骤得到has-mir-129（GFP）质粒，采用脂质体介导的基因转染技术，将has-mir-129（GFP）质粒转染肾癌SN12-PM6细胞，用流式细胞仪筛选带有绿色荧光的肾癌SN12-PM6细胞；MTT法检测细胞的生长曲线，检测细胞的同质黏附能力，Boyden小室检测细胞的侵袭及迁移能力，Brdu渗入法检测细胞的增殖能力。结果显示：转染has-mir-129（GFP）后肾癌SN12-PM6细胞的生长明显受到抑制，同质黏附能力下降，细胞的侵袭力和增殖能力明显减弱（P＜0.05），但对其S期无明显的差别（P＞0.05）。第二部分人肾细胞癌原位移植裸鼠肺转移模型建立的实验研究本部分主要通过建立肾癌原位肺转移动物模型，研究动物模型肾癌移植瘤和肺部转移瘤的生长情况，确定肾癌肺转移的初始时间。人肾癌细胞株SN12-PM6种植于裸鼠右肾实质内，连续观察裸鼠肾脏肿瘤及肺部转移瘤的生长情况。所有采用标本10％甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片HE染色后分析结果。结果显示：肾脏的成瘤率为100％（39／39），第5周开始观察到肿瘤的肺转移灶，肺部转移率50％（4／8），在随后3周其肺部转移率分别为75％（3／4），100％（8／8）及100％（7／7），肠道、肝脏、脾脏等脏器未发现明显的转移灶。第三部分has-mir-129影响人肾细胞癌原位移植裸鼠肺转移模型的实验研究本部分主要建立人肾细胞癌原位移植裸鼠肺转移动物模型，研究has-mir-129对肾脏移植瘤和肺部转移瘤的影响。人肾癌细胞株SN12-PM6建立的动物模型作为对照组，感染携带has-mir-129（GFP）慢病毒的肾癌细胞建立的动物模型作为实验组，7周后观察裸鼠肾脏肿瘤及肺部转移瘤的生长情况，并分别计算两组的肾脏成瘤率、肺部转移率及肿瘤的重量；所有的标本均采用10％甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片、HE染色后分析结果。结果显示：对照组肾脏的成瘤率为100％（8／8），肺部转移率100％（8／8），肿瘤的重量平均为（0.7128±0.1474）g；实验组肾脏成瘤率为100％（8／8），肺部转移率为62.5％（5／8），肿瘤的重量平均为（0.4815±0.1112）g；肾脏成瘤率两者之间无明显差异，统计学显示两组之间肿瘤的重量和肺部转移率有显著性差异，P＜0.05。结论1．体外转染has-mir-129（GFP）后肾癌SN12-PM6细胞的生长明显受到抑制，同质黏附能力下降，细胞的侵袭力和增殖能力明显减弱。2．转染has-mir-129（GFP）转染后能抑制肾癌SN12-PM6细胞的生长，但其S期无明显差别，推测其机制可能与G1受抑制有关。3．成功构建人肾细胞癌原位裸鼠肺转移动物模型，为肾癌特别是肾癌肺部转移提供了一个非常理想的研究模型。4．人肾细胞癌原位裸鼠肺转移动物模型建立后5周出现肺部转移灶，其肺部转移率为50％，肠道、肝脏、脾脏等器官未见明显的转移灶。5．我们成功建立了人肾细胞癌原位移植裸鼠肺转移动物模型，has-mir-129（GFP）能抑制人肾细胞癌原位移植裸鼠肺转移模型移植瘤的生长与肺部转移瘤的形成。综述microRNAs及其在泌尿系肿瘤的研究进展microRNAs（miRNAs）是一类分布十分广泛的内源性非编码RNA，在动物、植物、病毒中广泛存在。miRNAs与肿瘤的发生发展预后有关，并在肿瘤的增殖、分化及调亡等方面有重要的作用。结合最近相关文献，就miRNAs与泌尿系肿瘤方面的进展作简要概述。

论文目录

• 缩略词一览表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 has-mir-129转染SN12-PM6肾癌细胞株对其生长影响的实验研究
• 论文摘要
• 论文正文
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 第二部分 人肾细胞癌原位移植裸鼠肺转移模型建立的实验研究
• 论文摘要
• 论文正文
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 第三部分 has-mir-129影响人肾细胞癌原位移植裸鼠肺转移模型的实验研究
• 论文摘要
• 论文正文
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 综述 miRNAs及其在泌尿系肿瘤的研究进展
• 论文摘要
• 论文正文
• 参考文献
• 附录 （攻读博士学位期间发表论文目录）
• 致谢