论文摘要
【C1ORF102基因的克隆、前期研究结果】近年来基因芯片技术被广泛应用于肿瘤研究。我室聂新民博士采用基因芯片筛查鼻咽癌细胞系HNE1与鼻咽原代培养上皮细胞之间的差异表达基因,从中筛选并克隆得到一个表达下调的新基因C1ORF102,最初命名为NOR1（oxidored-nitro domain containingprotein 1）。该基因定位于鼻咽癌高频等位基因杂合性丢失位点1p34.2,不仅在鼻咽癌组织中表达下调,而且检测到存在点突变。采用病例-对照的研究方法,熊炜等人证实C1ORF102（NOR1）基因编码区两个SNP位点之间存在连锁不平衡,且都与鼻咽癌发病相关。利用高通量的组织芯片进行原位杂交实验发现,C1ORF102（NOR1）基因mRNA在鼻咽癌中广泛下调。通过全基因组基因表达芯片筛查显微切割纯化的鼻咽癌组织和正常鼻咽上皮之间的差异表达基因,经SAM（Significance Analysis of Microarray）分析发现C1ORF102基因位列488个表达下调基因中的第6位,强烈提示C1ORF102基因在鼻咽癌发生过程中起到非常关键的作用。【C1ORF102编码蛋白的组织与亚细胞定位:鉴定其为鼻咽-气管组织相对特异性表达的线粒体蛋白】抗体是基因功能研究重要的工具。为了制备C1ORF102多克隆抗体,采用pET原核表达系统表达并纯化C1ORF102全长蛋白。将重组蛋白免疫新西兰兔,制备获得抗C1ORF102蛋白多克隆抗体。该抗体特异性好,效价高,可应用于Western blot（1:10000）、免疫组化（1:5000-10000）以及免疫荧光（1:500-1000）检测。应用该抗体研究发现,C10RF102在鼻咽组织、气管组织中高表达,在大脑和脊髓有微弱表达,而在心脏、肝脏、脾脏、胃、肾脏、肺、结肠、胸腺、骨骼肌、胰腺等组织中没有表达。采用RT-PCR检测也发现,C1ORF102基因mRNA在鼻咽、气管高表达,在脑组织存在微弱表达。免疫组化分析进一步证实,C1ORF102蛋白在鼻咽、气管、支气管上皮中呈强阳性表达,在鼻咽部腺体以及气管周边腺体有中等程度表达。而在心脏、肝脏、脾脏、胃、肾脏、肺、结肠、胸腺、骨骼肌、胰腺以及表皮等组织中未检测到阳性表达。有趣的是,我们发现,C1ORF102蛋白在中枢神经系统神经元中呈阳性,在胶质细胞中没有表达。该结果说明C1ORF102基因是一个新的组织特异性/选择性基因。在研究过程中还发现C1ORF102基因存在第二外显子选择性剪切。C1ORF102基因全长编码389aa,选择性剪切差异本编码379aa,不包括第二外显子。通过RT-PCR结合测序的方法分析了C1ORF102基因全长及剪切差异本在人胚胎组织及多种细胞系中的分布,结果表明,C1ORF102全长（389aa）仅见于脑组织,而脑组织同时也表达编码379aa的剪切本;鼻咽、气管组织仅表达379aa剪切本;在永生化成人正常鼻咽上皮细胞系NP69及鼻咽癌细胞系中表达的也是379aa差异本。前期研究发现在Hela细胞中瞬时转染C1ORF102表达质粒,C1ORF102蛋白表达于线粒体。免疫荧光检测表明NP69细胞中内源性C1ORF102蛋白与线粒体存在明显共定位特征。随后采用密度梯度离心方法分离NP69细胞线粒体和胞浆蛋白组分,Western blot检测发现内源性C1ORF102蛋白绝大部分定位于线粒体,且分子量较胞浆中的C1ORF102稍大,可能源于线粒体内存在某种翻译后修饰。上述结果表明天然C1ORF102蛋白是一个线粒体蛋白。另外我们发现外源性稳定表达的C1ORF102蛋白同样主要定位于线粒体。免疫电镜观察发现在5-8F细胞中瞬时转染myc-C1ORF102蛋白定位于线粒体。【C1ORF102在鼻咽癌中表达下调,转染C1ORF102抑制5-8F细胞生长与增殖,逆转5-8F细胞对缺氧的耐受能力】通过realtime RT-PCR、Western blot检测发现C1ORF102基因mRNA及蛋白在鼻咽癌细胞系（HNE1、HNE2、6-10B、5-8F）中表达下调,在5-8F细胞中检测不到C1ORF102蛋白表达。采用免疫组化检测发现C1ORF102蛋白在鼻咽癌组织中表达下调。为了研究C1ORF102基因是否是鼻咽癌抑瘤基因,基因转染建立稳定表达C1ORF102基因的5-8F细胞系,生长曲线、平板集落形成实验、软琼脂克隆形成实验显示C1ORF102具有抑制5-8F细胞生长和增殖的作用。流式细胞仪检测细胞周期发现,转染C1ORF102基因的5-8F细胞在G1期的比例增高,S期的比例下降,引起细胞周期G1-S期阻滞。Western blot检测发现转染C1ORF102基因引起cyclinD1、cyclinB1、c-Myc、CDK4和磷酸化Rb表达下调,上调p53表达。同时转染C1ORF102引起凋亡分子Bax、caspase3蛋白表达上调。更为重要的是,我们发现C1ORF102基因强烈抑制了5-8F细胞在化学缺氧状态下的生长与增殖能力。采用流式细胞计数及Hoechst 33258染色都证明C1ORF102基因显著促进了在缺氧状态下5-8F细胞的凋亡。将稳定转染的细胞接种裸鼠,发现转染C1ORF102基因可以明显抑制裸鼠移植瘤的生长,但不影响肿瘤细胞的分化水平。HE染色还发现在转染C1ORF102基因的5-8F细胞形成的移植瘤内,可见细胞坏死区域,该结果也提示C1ORF102可能具有逆转鼻咽癌细胞耐受缺氧的作用。【C1ORF102对鼻咽癌细胞系5-8F线粒体基因表达谱以及能量代谢和信号通路的影响】通过密度梯度离心分离线粒体和胞浆蛋白,应用Western blot检测发现,稳定转染的C1ORF102蛋白绝大部分定位于线粒体内,胞浆中有少量表达。应用基因芯片筛查C1ORF102对鼻咽癌细胞5-8F基因转录组的影响,发现共95个线粒体基因表达上调,这些上调的基因包括线粒体转录因子、线粒体翻译起始因子、线粒体核糖体蛋白、电子传递链组分蛋白、凋亡相关因子等。有8个线粒体靶向蛋白在转染C1ORF102基因后表达下调,其中包括丙酮酸脱氢酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase 1,PDK1）。同时,我们还发现转染C1ORF102下调了葡萄糖转运受体GLUT3以及糖酵解关键酶6-磷酸果糖激酶（PFKL）的表达。有趣的是,PDK1、GLUT3、PFKL三者都是HIF1的靶基因。采用realtime RT-PCR检测了FXN、MRPS6、PDK1、GLUT3、PFKL mRNA表达水平,结果表明与芯片结果一致,另外还通过Western blot检测了PDK1、PFKL蛋白表达水平,证实转染C1ORF102引起PDK1、PFKL蛋白表达下调。随后我们考察了转染C1ORF102基因细胞的代谢特征,结果表明转染C1ORF102基因后5-8F细胞乳酸产量降低,而线粒体膜电位增高,与此同时,细胞内ATP含量明显增高,提示5-8F细胞糖酵解受抑制,能量代谢方式向线粒体有氧代谢转变。全基因组基因芯片筛查还发现转染C1ORF102基因引起多个信号通路分子表达水平改变。其中多个分子涉及MAPK信号通路。为了进一步考察C1ORF102基因对MAPK信号通路的影响,通过Western blot检测MAPK信号通路关键分子的表达与活化。结果发现,转染C1ORF102并不影响NF-κB、total ERK1/2、total p38以及JNK2表达水平,但是抑制了p-ERK1/2、p- p38的表达水平,提示MAPK信号通路受抑制。基因芯片结果还发现Wnt/β-catenin信号通路分子Wnt5A、Wnt10A、FZD7、FZD5表达下调,采用realtimeRT-PCR方法检测Wnt5A、FZD7、FZD5 mRNA表达水平,证实三者在转染C1ORF102后表达显著下调。通过Western blot和免疫荧光检测β-catenin的表达和分布,结果表明:转染NOR1并不引起β-catenin表达水平改变,但是抑制了β-catenin从膜/胞浆向细胞核内转位,在转染C1ORF102的细胞内,定位于细胞核的β-catenin显著减少,表明Wnt/β-catenin信号通路受抑制。【采用酵母双杂交系统筛选C1ORF102交互作用蛋白,发现并证明C1ORF102通过OSCP蛋白与线粒体ATP合成酶发生交互作用】为了进一步明确C1ORF102基因的生物学功能,采用酵母双杂交技术筛选C1ORF102基因相互作用蛋白。以C1ORF102基因为诱饵,筛选人胎脑cDNA文库,得到15个阳性克隆,经测序发现代表7个不同的基因,分别为金属硫蛋白2A、神经元特异性的细胞间黏附分子（ICAM5）、线粒体ATP合成酶（FoF1-ATPase）亚基寡霉素敏感蛋白OSCP、微管相关蛋白MAP1S、补体C2、羧肽酶CPE和一个半胱氨酸富集的BMP调节因子CRIM2。因为C1ORF102是一个线粒体蛋白,因此我们推测C1ORF102与OSCP发生交互作用的可能性较大。首先采用特异性酵母双杂交证实C1ORF102与OSCP在酵母细胞内存在直接交互作用。免疫荧光共定位分析发现不论内源性还是外源性C1ORF102与OSCP在细胞内都存在明显共定位。进一步采用免疫共沉淀证实C1ORF102与OSCP蛋白在线粒体内存在交互作用。C1ORF102促进化学缺氧引起的凋亡作用部分依赖于线粒体ATP合成酶活性,当采用线粒体ATP合成酶抑制剂oligomycin阻断其酶活性后,C1ORF102促进化学缺氧引起的凋亡能力也随之下降。C1ORF102通过OSCP蛋白与ATP合成酶交互作用调节其酶活性,可能是转染C1ORF102基因后ATP含量增加的原因之一。