论文摘要
传染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）是危害世界养禽业的主要传染病之一，其病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）主要侵害雏鸡的中枢免疫器官法氏囊，导致免疫抑制。VP1是一种依赖RNA的RNA聚合酶，与IBDV的复制效率和毒力的关系日趋成为研究IBDV的热点。笔者现有资料，国内关于IBDV VP1的表达、单克隆抗体的制备和稳定表达VP1细胞系的建立尚未见报道。本研究的目的之一是构建IBDV VP1基因的原核表达载体，以原核表达的VP1蛋白为免疫原制备特异性单克隆抗体，制备的单克隆抗体可以为下一步建立细胞系提供检测的物质条件；目的之二构建IBDV VP1基因的真核表达载体，建立稳定表达VP1蛋白的Vero E6细胞系，为深入研究VP1与病毒复制和毒力的关系奠定基础。本课题主要研究内容包括以下几方面：1．IBDV VP1的原核表达及其多克隆抗体的制备从已构建含有IBDV Gt株B节段的质粒中扩增出VP1基因，将其克隆到表达载体pET32a。转化感受态细胞E.coli DH5α，获得重组阳性质粒pET32a-VP1。将pET32a-VP1转化宿主菌BL21（DE3），在IPTG诱导下成功表达了约115 ku的VP1融合蛋白，并以包涵体形式存在。用电泳法纯化蛋白并免疫BALB/c小鼠，制备了多克隆抗体。Western blot分析表明，纯化的蛋白能够被抗His单克隆抗体和IBDV阳性血清识别。ELISA分析表明，制备的融合蛋白抗血清效价在1：12800以上。间接免疫试验表明，多克隆抗体能与自然结构的IBDV发生特异性反应。2．IBDV VP1单克隆抗体的制备与鉴定取上面免疫小鼠的脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞常规融合，依次进行HAT选择培养，间接ELISA法筛选阳性克隆，有限稀释法进行单克隆化。获得了C4、D4两株能稳定分泌抗IBDVVP1的杂交瘤细胞株，并对C4、D4进行了稳定性、特异性方面的鉴定。腹水的效价分别为1×105和1×102，IgG亚类鉴定均为IgG1。3．稳定表达IBDV VP1的Vero E6细胞系的建立将IBDV Gt株的VP1基因分别克隆到真核表达载体pCI-neo和pEGFP-N1，获得真核表达质粒pCI-neo／VP1和pEGFP-N1／VP1。在脂质体介导下，将其导入Vero E6细胞，进行瞬时表达分析。经G418筛选后得到稳定转染细胞株，用有限稀释法获取亚克隆细胞株。然后通过间接免疫荧光和RT-PCR检测VP1基因在Vero E6细胞中的稳定表达情况。经过RT-PCR检测到该细胞中有VP1 mRNA的表达，用间接免疫荧光法可以在稳定转染质粒pCI-neo／VP1的Vero E6细胞上检测到较强的绿色荧光，证实Vero E6细胞内有VP1蛋白的表达。获得了稳定表达VP1蛋白的Vero E6细胞系。
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标签：传染性法氏囊病病毒论文; 原核表达论文; 单克隆抗体论文; 真核表达论文; 稳定表达细胞系论文;