论文摘要
抗菌肽是生物体受到外界病原微生物入侵,由特定基因编码产生的一类小分子多肽。与传统抗生素相比,抗菌肽具有分子量低、水溶性好、热稳定、广谱抗菌、不易产生耐药性等特点,显示出了良好的临床应用前景。由于抗菌肽在体内含量低,分离纯化较困难,而化学合成成本较高,难以满足基础研究和临床治疗的需要,因此,以基因工程的方法制备抗菌肽是一种有效的方法。由于抗菌肽能够杀伤原核细菌,不宜在原核宿主菌中直接表达,只能采用原核融合表达或在酵母中分泌表达。本文就抗菌肽Cecropin D的克隆、表达、纯化及其体外的抗菌活性进行了初步的探讨。首先,我们根据抗菌肽Cecropin D的氨基酸序列,选择大肠杆菌偏爱的密码子,人工合成了6条寡聚核苷酸片段,经磷酸化、退火、连接及PCR并克隆入表达载体pThioHisA。优化表达条件后,pThioHisA-eCD在大肠杆菌中获得大量表达,表达量占菌体蛋白总量的15%。经CM-sepharose Fast Flow层析柱纯化后,获得了90%以上纯度的融合蛋白。融合蛋白pThioHisA-eCD免疫豚鼠,获得抗血清。接着,我们又选择毕赤酵母偏爱的密码子,采用同样的方法将合成的yCD基因片段与α因子信号肽连接,并克隆入酵母表达载体pPIC9K。重组表达质粒pPIC9K-α-yCD经SalⅠ线性化后,电转化毕赤酵母宿主菌GS115,经G418浓度加压筛选,从200个转化子中筛选到4个高拷贝的转化子。经过PCR鉴定,α-yCD基因已经完全整合到酵母基因组中。高拷贝的阳性克隆用0.5%的甲醇诱导表达,表达上清经CM-sepharose Fast Flow层析柱纯化,Tricine-SDS-PAGE检测,在相对分子量3.9KD处可见特异性的蛋白条带,且纯化后的目的蛋白Cecropin D纯度达90%以上,表达量可达21.3mg/L培养液。Western blot分析显示该目的蛋白能够与融合蛋白pThioHisA-eCD免疫豚鼠获得的抗血清发生特异性的反应。通过琼脂糖扩散法和比浊法测定表明:Cecropin D在体外具有广谱抗菌活性,对大部分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制作用。而且抗菌肽Cecropin D在沸水中煮沸30min后,抗菌活性仍然不变,说明其具有良好的热稳定性。总之,本研究成功构建了抗菌肽Cecropin D原核融合表达或酵母分泌表达的重组表达载体,均获得了高效、稳定的表达,摸索了纯化方案,并在体外对毕赤酵母表达产物CecropiIl D的抗菌活性进行了初步的研究,为进一步研究抗菌肽的表达水平、抗菌效力及作用机理等提供了基础,也为其大量生产从而开发新型抗菌药物奠定了一定的基础。
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相关论文文献
- [1].抗菌肽Cecropin D在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定[J]. 中国生物制品学杂志 2008(03)
- [2].抗菌肽Cecropin D基因在毕赤酵母中的表达与抗菌活性分析[J]. 中国预防兽医学报 2011(11)
- [3].家蚕抗菌肽Cecropin D基因的原核表达、纯化及抑菌活性测定[J]. 中国蚕业 2011(04)
标签：抗菌肽论文; 基因合成论文; 大肠杆菌论文; 融合表达论文; 毕赤酵母论文; 分泌表达论文; 蛋白纯化论文; 抗菌活性论文;