岩黄连中小檗碱型生物碱生物合成途径相关基因的研究及藜芦中甾体生物碱的微生物转化

论文摘要

岩黄连为罂粟科植物石生黄堇（Corydalis saxicola Bunting）的全草,是一种名贵的中药材主要分布在贵州,云南,四川,广西等省,对环境条件要求十分苛刻,野生状态下只生长在石灰岩地区阴湿的岩洞口,被列入中国南部濒危植物名录。岩黄连具有清热解毒、利湿、止痛止血之功效,在临床上主要药理活性有抗菌,抗病毒,抗癌。岩黄连中的活性成分为小檗碱型生物碱类化合物,而这类化合物具有潜在的抗HBV活性和肝保护活性。本文对岩黄连中小檗碱类生物碱生物合成途径中的相关酶基因进行了克隆、表达及功能分析。岩黄连中（S）-四氢小檗碱氧化酶的克隆,表达及功能分析（S）-四氢小檗碱氧化酶是小檗碱生物合成途径中的关键酶,是黄连小檗碱的合成途径中最后一个酶,将（S）-四氢小檗碱氧化成小檗碱。通过RACE获得了（S）-四氢小檗碱氧化酶cDNA全长序列,其长度为1127bp,含有5’-UTR, 3’-UTR,ploy （A）+结构以及一个699bp的开放阅读框架,编码232个氨基酸残基,预测分子量为25.20 kDa。将该基因注册到GenBank,编号为HQ393909。RT-PCR分析表示（S）-THBO在岩黄连植株的根、茎、叶、花中都有表达,在根中表达量最高。诱导实验表明（S）-THBO具有明显的防御作用。将（S）-四氢小檗碱氧化酶构建表达载体并在大肠杆菌中表达,并对表达（S）-四氢小檗碱氧化酶的大肠杆菌对底物进行体内转化。表达（S）-四氢小檗碱氧化酶的大肠杆菌可以体内转化（S）-四氢小檗碱氧化成小檗碱,但对底物有一定的选择性,不能将内消旋四氢小檗碱转化完全。岩黄连中（S）-去甲乌药碱合成酶的克隆（S）-去甲乌药碱合成酶是原小檗碱生物合成途径中的第一个酶,它可以将多巴胺（Dopamine）和（4-羟苯乙酮4-hydroxyphenylhydroxyphenylacetaldehyde,（4-HPAA） ）催化成（S）-去甲乌药碱（ （S）-Norcoclaurine）。对岩黄连的总RNA进行PT-PCR得到一段（S）-去甲乌药碱合成酶的核心片段。通过RACE获得了（S）-去甲乌药碱合成酶cDNA全长序列,其长度为1003bp,含有5’-UTR, 3’-UTR,ploy （A）+结构以及一个621bp的开放阅读框架,编码207个氨基酸残基。将该基因注册到GenBank,编号为JF488074。岩黄连中氢化小檗碱合酶的克隆氢化小檗碱合酶位是原小檗碱类生物碱生物合成途径的下游基因,它的功能是将（S）-四氢非洲防己碱（ （S）-THC）催化成（S）-四氢小檗碱（ （S）-THB）,使化合物形成特殊的亚甲基双氧环结构。通过RACE获得了氢化小檗碱合酶cDNA全长序列,其长度为1256bp,含有5’-UTR, 3’-UTR结构以及一个783bp的开放阅读框架,编码261个氨基酸残基。将该基因注册到GenBank,编号为HQ393908。第二部分藜芦中甾体生物碱的微生物转化藜芦（Veratrum Linn. ）为百合科（Liliaceae）多年生草本植物,味辛、苦,性寒,有毒。中医用藜芦（V.nigrum L. ）、兴安藜芦（V.dahuricum（Turcz.）Loes.f.）、天目藜芦（V.Schindleri L）等的根和茎共同入药,用于中风痰壅、癫痫、喉痹不通、头痛、疥癣、疟疾。藜芦属植物中的生物碱类成分为其主要的活性成分,现代临床药理研究表明,甾体生物碱具有降血压作用、抗肿瘤作用、杀虫、抗血吸虫、抗真菌及等作用。据统计数据表明从我国所有藜芦属植物中分离得到100余种甾体生物碱。藜芦的毒素同样为生物碱类成分。微生物转化反应是利用微生物的酶对底物的某一部位进行特定的化学反应来获得一定的产物,其在药物生产中占有重要地位。因为藜芦属植物中甾体生物碱具有良好的抗肿瘤活性,在实验室前期研究结果的基础上对藜芦中有效的甾体生物碱成分利用微生物转化的方法对其进行结构修饰和改造,合成系列衍生物,以期获得高效、低毒、高特异性的Hedgehog通路抑制剂,为新型抗肿瘤药物的开发提供理论基础。本课题利用刺孢小克银汉霉对生物碱藜芦胺进行微生物转化,共得到了5个化合物,都为新化合物。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号缩写说明
• 第一部分 岩黄连中小檗碱型生物碱生物合成途径相关基因的研究
• 第一章 绪论
• 一、岩黄连简介
• 二、药用植物次生代谢研究现状
• 三、小檗碱型生物碱代谢途径
• 四、发根研究进展及岩黄连发根体系的建立
• 五、本文的研究内容
• 第二章 岩黄连发根培养体系的建立与诱导
• 一、材料与试剂
• （一） 植物材料
• （二） 菌种
• （三） 主要仪器设备
• （四） 试剂及药品
• 二、实验方法
• （一） 无菌苗的获得
• （二） 岩黄连发根的诱导与鉴定
• 三、实验结果
• （一） 岩黄连无菌苗的获得
• （二） 岩黄连发根的诱导，优化与鉴定
• （三） 岩黄连发根药用活性成分的测定以及与岩黄植株成分的比较
• 四、小结与讨论
• 第三章 岩黄连中原小檗碱类生物碱生物合成相关基因的研究
• 一、岩黄连CS（S）-THBO 基因的克隆、表达及功能分析
• （一） 材料与方法
• （二） 实验方法
• （三） 实验结果
• （四） 小结与讨论
• 二、岩黄连CS（S）-NCS 基因的克隆克隆、表达及功能分析
• （一） 材料与方法
• （二） 实验方法
• （三） 实验结果
• （四） 小结与讨论
• 三、岩黄连CSCSN 基因的克隆、表达及功能分析
• （一） 材料与方法
• （二） 实验方法
• （三） 实验结果
• （四） 小结与讨论
• 第四章 总结与展望
• 一、总结
• 二、展望
• 参考文献
• 第二部分 藜芦中甾体生物碱的生物转化
• 第一章 微生物转化研究的现状与前景
• 一、概述
• 二、微生物转化反应的特点
• （一） 对立体结构具有高度的专一选择性
• （二） 反应条件温和，设备简单，公害少，反应速率快
• （三） 反应收率高、成本低
• （四） 可以减少反应步骤
• 三、微生物转化的应用
• （一） 在化学合成反应中的应用
• （二） 在手性药物对映体拆分和不对称药物合成中的应用
• （三） 在体外预测代谢产物中的应用
• 四、微生物转化研究的展望
• 五、微生物转化的一般实验方法
• （一） 微生物转化的实验过程
• （二） 微生物转化方法
• 第二章 藜芦中甾体生物碱研究进展及本论文立题依据
• 一、概述
• 二、藜芦的化学成分
• 三、藜芦的药理活性及毒性
• （一） 降血压作用
• （二） 抗肿瘤作用
• （三） 对神经系统的作用
• （四） 对心脏的影响
• （五） 杀虫、抗血吸虫、抗真菌及等作用
• 四、藜芦的毒性毒理
• 五、本论文立题依据
• 第三章 实验部分
• 一、实验仪器与材料
• （一） 菌种
• （二） 培养基
• （三） 实验仪器
• （四） 药品及试剂
• 二、 预实验
• （一）菌种的复活及保存
• （二）预实验
• 三、 放大实验
• 四、生物转化的 LC/MS 分析
• 五、 转化产物的分离
• 六、实验结果
• （一）生物转化的 LC/MS 分析
• （二）分离得到的新化合物
• （三）转化产物的结构鉴定
• 七、转化产物的理化常数及波谱数据
• 第四章 小结与讨论
• 参考文献
• 博士期间发表论文情况
• 致谢