中药材中细菌群体感应效应剂的筛选和研究

论文摘要

群体感应(quorum sensing,QS)是细菌根据细胞密度变化进行基因表达调控的一种生理行为。随着细胞密度增加,细菌产生的信号分子浓度逐渐增加,当信号分子积累到一定浓度时会启动相关基因的表达,如共生、细菌毒性、竞争、接合、抗生素的产生、运动性、孢子及生物膜的形成等。筛选各种QS效应剂可以调节和控制细菌的各种行为,因此具有非常重要的生物学意义和实际应用价值。本研究利用对AHLs敏感的指示菌C. violaceum CV026的显色反应,尝试从中国传统的中药材中筛选天然的QS效应剂。研究中首先确立了AHLs信号分子的提取途径和固体平板检测方法,然后探讨了液体培养基中半定量检测信号分子的影响因素,发现以乙醇溶解紫色素的方法优于水饱和丁醇法萃取紫色素,乙醇的最适使用浓度为55.6%,最适检测波长为580nm。从多种中药材中筛选QS效应剂的研究表明,与单独添加信号分子相比,连翘等八种中药和信号分子一起添加时C. violaceum CV026的紫色减弱,其中可能含有细菌群体感应抑制剂;而三种药材鱼腥草、金银花、柴胡和信号分子一起添加C. violaceum CV026分泌紫色增强,其中可能含有AHLs功能的类似物。然后进一步确定了三种中药材中的增色作用物质是药材自身所含有,而非外源污染所致。鱼腥草可能含有与信号分子协同使C. violaceum CV026显色增强的物质,而非AHLs功能类似物;柴胡和金银花单独均可使C. violaceum CV026显色,表明该物质中含有信号分子的功能类似物,且柴胡中的活性物质含量远远大于金银花。此外,研究中还初步探讨了柴胡中细菌群体感应效应剂的提取方法,发现以水作为提取剂,浸泡3d获得的AHLs类似物最多。将柴胡的浸提液以正己烷去除非极性物质后,用乙酸乙酯反萃取,可得到较高纯度的AHLs类似物。进一步的研究表明,该物质的水溶液呈酸性(pH1),对碱性环境非常敏感,但是在高温条件下比较稳定。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 细菌的群体感应系统
• 1.1.1 革兰氏阴性菌的群体感应系统
• 1.1.2 革兰氏阳性菌的群体感应系统
• 1.1.3 细菌种间群体感应QS 系统（AI-2 型信号系统）
• 1.1.4 其它的信号分子及群体感应系统
• 1.2 病原菌的群体感应与信号干预
• 1.3 细菌群体感应效应剂
• 1.3.1 天然的群体感应效应剂
• 1.3.2 人工合成的群体感应效应剂
• 1.4 细菌群体感应效应剂的作用机理
• 1.4.1 革兰氏阴性细菌的信号干扰途径
• 1.4.2 革兰氏阳性细菌的信号干扰途径
• 1.5 研究意义、目的及内容
• 1.5.1 研究的意义及目的
• 1.5.2 研究的主要内容
• 第二章 细菌群体感应效应剂筛选方法的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验用菌株
• 2.1.2 实验培养基及抗生素
• 2.1.3 信号分子的制备
• 2.1.4 指示菌CV026 生长曲线的测定
• 2.1.5 AHLs 信号分子及其效应物的生物检测
• 2.1.6 不同菌种信号分子对CV026 的显色影响
• 2.1.7 紫色素含量的测定方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 指示菌CV026 生长曲线的测定
• 2.2.2 菌株M18 培养时间与AHLs 浓度之间的关系
• 2.2.3 不同菌种中AHLs 浓度的检测
• 2.2.4 CV026 分泌的紫色素含量的测定
• 2.2.5 AHLs 加入量与紫色素浓度之间的关系
• 2.3 小结
• 第三章 细菌群体感应效应剂的筛选
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验用菌株
• 3.1.2 实验培养基及抗生素
• 3.1.3 筛选范围
• 3.1.4 药品提取液体的制备
• 3.1.5 信号分子的提取方法
• 3.1.6 筛选方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 中药材筛选结果
• 3.2.2 中药材增色作用的确认
• 3.3 小结
• 第四章 柴胡中的细菌群体感应效应剂
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验用菌株
• 4.2.2 实验培养基及抗生素
• 4.2.3 实验用柴胡
• 4.2.4 筛选细菌群体感应效应剂的方法
• 4.2.5 柴胡外生菌
• 4.2.6 柴胡中AHLs 类似物的提取方法
• 4.2.7 柴胡中AHLs 类似物的纯化
• 4.2.8 酸碱处理柴胡中AHLs 类似物
• 4.2.9 高温处理柴胡中AHLs 类似物
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 检测几种柴胡中的群体感应效应剂
• 4.3.2 柴胡外生菌
• 4.3.3 柴胡中AHLs 类似物提取方法的优化
• 4.3.4 柴胡中AHLs 类似物的初步纯化
• 4.3.5 柴胡中AHLs 类似物对酸碱的稳定性
• 4.3.6 柴胡中AHLs 类似物对高温的稳定性
• 4.4 小结
• 第五章 总结
• 参考文献
• 附录 实验所用仪器及设备
• 致谢