链霉亲和素—荧光藻胆蛋白的构建及在荧光免疫检测中的应用

论文摘要

荧光免疫检测技术在现实生活中应用日益广泛,遍及环境污染物监测、医学检验、食品检验等诸多领域,发展迅速。本研究所涉及的生物素-链霉亲和素系统（BSA）是具有灵敏度高、特异性强和稳定性好的信号多级放大系统;同时藻胆蛋白的光学和物理性质非常符合新一代荧光免疫标记物的要求。本研究以pUC57-sa质粒为模板,通过PCR反应扩增出目的基因片段sa,构建表达载体pETDuet-sa。通过大肠杆菌异源表达,成功制备核心链霉亲和素,对其表达、活性和保存条件等方面进行研究,其分子量为59.2KD,理论活性为16.5u,实测活性16.3u,冻干后可以稳定保存。将SA-CpcB、藻红胆素合成酶及藻胆蛋白裂合酶进行大肠杆菌体内共表达,得到融合色素蛋白SA-CpcB-PEB。检测SA-CpcB-PEB的荧光活性,同时将其用于BSA系统中进行荧光免疫检测,表明SA-CpcB-PEB同时具有藻胆蛋白的荧光特性和SA与生物素结合的能力。将SA-CpcB-PEB作为荧光探针应用于BSA荧光免疫检测体系检测微量物质,证实SA-CpcB-PEB作为荧光探针应用于荧光免疫检测体系具有实用意义。通过研究温度、pH、抑制剂对SA-CpcB-PEB活性以及稳定性的影响,得到其适宜保存条件是4℃、终浓度为1mM EDTA、0.05﹪NaN3、pH为中性、20mM KPB、150mM NaCl的环境,有利于其具体应用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 序言
• 1.1 免疫测定技术
• 1.2 藻胆蛋白的研究进展
• 1.3 链霉亲和素
• 1.4 研究意义及展望
• 2 核心链霉亲和素的制备及性质研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 SA 克隆实验结果
• 2.4 SA 活性检测
• 2.5 SA 诱导表达条件优化
• 2.6 SA 保存条件研究
• 2.7 本章小结
• 3 融合蛋白SA-CpcB-PEB的活性检测及在荧光免疫检测中的应用研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.3 重组蛋白质光谱分析及荧光量子产率和摩尔消光系数的计算
• 3.4 SA-CPCB-PEB 的聚丙烯酰胺凝胶电泳和色素蛋白的锌电泳
• 3.5 藻胆蛋白荧光探针应用于BSA 荧光免疫检测体系检测微量物质
• 3.6 荧光免疫检测体系优化
• 3.7 融合蛋白SA-CPCB-PEB 的免疫活性检测
• 3.8 SA-CPCB-PEB 应用于BSA 荧光免疫检测体系检测微量物质
• 3.9 本章小结
• 4 融合色素蛋白SA-CpcB-PEB 稳定性研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.3 PH 对SA-CPCB-PEB 活性的影响
• 4.4 温度对SA-CPCB-PEB 活性的影响
• 4.5 蛋白酶抑制剂对SA-CPCB-PEB 稳定性的影响
• 4.6 本章小结
• 5 全文总结
• 致谢
• 参考文献
• 附录1 缩略词（ABBREVIATION）