论文摘要
研究背景：糖尿病是当今对人类健康最具威胁性的疾病之一,随其发病率的逐年增加,其危害性也越来越显著,给患者及社会带来严重的经济负担。糖尿病存在多种并发症,对机体的重要脏器和组织都造成严重损害。其中糖尿病心脏自主神经病变（diabetic cardiac autonomic neuropathy, DCAN）是最严重但却最容易被忽视的并发症之一。流行病学研究资料显示约有35%-65%左右的糖尿病患者会并发心脏自主神经病变,且随糖尿病病程延长发病率呈增长趋势,最终导致恶性心律失常、心力衰竭、心肌梗死以及心源性猝死的发生率显著增加,严重威胁糖尿病患者的健康。近期多项研究表明合并DCAN的患者其室性心律失常发生率较单纯糖尿病患者显著增加,且多伴有明显的QT间期延长,严重者甚至导致猝死发生率增加,但关于其导致室性心律失常的机制和有效干预治疗方面的研究甚少。心脏自主神经包含交感神经及迷走神经,二者互为补充也互相拮抗,共同精细地调节着心脏的生理功能。长期高血糖状态可引起缺血缺氧、氧化应激、多元醇通路、晚期糖基化终末产物以及神经生长营养因子的缺乏等多因素的激活,这些综合因素协同作用造成心脏自主神经的损伤。由于迷走神经节前纤维较长,对缺氧耐受性差,故在糖尿病自主神经病变中,迷走神经损伤较早且较重,后期迷走、交感神经均受累,但在不同部位受累程度存在差异,形成类似去神经支配的心脏。任何心脏自主神经的去神经化不均衡,其中包含区域性交感神经间的分布不均匀、交感与迷走神经间的失衡等,均会导致相应部位电生理的异质性增加,使室性心律失常发生率明显增加。既往研究证实在糖尿病神经病变大鼠心脏中存在交感神经分布的不均衡性,这种失衡尤其在左室近、远端表现更为突出。随糖尿病病程延长,左室远端交感神经去神经化的程度明显重于近端,形成由近及远的交感神经损伤梯度改变。而这种交感神经的去神经化趋势和该部位神经生长因子（nerve growth factor, NGF）的下调程度相互吻合。提示NGF的下调可能是参与DCAN的机制之一。本研究第一部分进一步探讨糖尿病大鼠在合并心脏自主神经损害时心脏左室近、远端NGF下调与交感神经去神经化程度的相关性,探索糖尿病中失衡的心脏交感神经分布与室性心律失常之间的关系,并在大鼠左侧星状神经节局部注射外源性NGF,观察其能否改善DCAN所导致的左室近、远端交感神经分布不均衡,从而减少室性心律失常的发生,以期为DCAN与其继发的室性心律失常的治疗提供新的思路。除心脏交感神经失衡引起室性心律失常发生率增加外,因交感和迷走神经对损伤的敏感程度不同,DCAN还会引起交感和迷走神经的失衡,这同样会造成心脏电生理的不稳定性增加,室性心律失常发生率随之增加。我们的思路是通过干预性治疗,改善糖尿病造成的心脏交感和迷走神经之间的失衡问题,增加电生理的稳定性,从而减少室性心律失常发生。间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）作为一种自体干细胞,具有很强的自我更新及增殖能力,并具有多向分化的潜能。MSCs在体内、体外特定诱导条件下可分化为神经元细胞及神经胶质细胞等,并可通过旁分泌机制分泌多种神经细胞营养因子,因此可作为理想的种子细胞用于神经系统损伤的治疗。鉴于MSCs的生物学特性,我们推断MSCs移植治疗可能会对DCAN产生积极有效作用。本研究第二部分中,我们在糖尿病大鼠模型基础上行心肌内MSCs移植,观察MSCs移植对DCAN的修复作用以及对心脏电生理稳定性的影响,探讨其修复甚至逆转糖尿病导致的心脏自主神经损害的机制,以期为DCAN提供新的治疗手段及理论依据。如上所述,本研究在既往研究基础上,进一步深入阐明NGF表达下调与糖尿病心脏交感神经去神经化的相关性,探讨DCAN与室性心律失常的关系,通过不同方法对DCAN进行干预性治疗,以期为糖尿病心脏自主神经病变及其继发的室性心律失常的防治提供新的治疗思路。为了详细阐明上述问题,本课题通过以下两部分研究进行探讨：第一部分神经生长因子干预对糖尿病大鼠心脏交感神经分布及室性心律失常的影响目的：明确糖尿病心脏左室交感神经病变特点,探讨NGF下调与左室交感神经去神经化的相关性,通过在糖尿病大鼠左侧星状神经节注入外源性NGF,以期为DCAN及其继发的室性心律失常的防治提供治疗思路。材料与方法：雄性Wistar大鼠随机分为3组：对照组（control组,n=12）；糖尿病组（DM组,n=16）；糖尿病+NGF干预组（DN组,n=16）。通过腹腔内注射链脲佐菌素（50mg/kg）制备糖尿病大鼠模型。糖尿病大鼠成模后继续喂养24周,DN组在左侧星状神经节内注射NGF（总量20μg/kg,分成4次注射完成,每隔3天注射一次）,DM组在左侧星状神经节注入同等体积的生理盐水。继续喂养至28周,所有存活大鼠测定空腹血糖及糖化血红蛋白,随后行程序性电刺激诱发室性心律失常,电生理试验结束后处死所有大鼠,立即取心脏左室近、远端心肌组织,采用免疫组织化学方法观察酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）阳性神经纤维分布及密度；实时定量RT-PCR检测心肌中TH mRNA、NGF mRNA表达;Western blot检测心肌组织中NGF蛋白表达。结果：DM组大鼠QTc和QTcd均比对照组大鼠显著延长（P<0.01）,且室性心律失常诱发率显著增加（46.5%vs.7.14%,P<0.01）。同时在DM组大鼠心脏左室的近、远端TH阳性神经纤维的密度和相应的TH mRNA以及NGF蛋白水平均分别比对照组显著降低（P<0.01）。且在DM组大鼠心脏左室近、远端TH阳性神经纤维的密度、相应的TH mRNA和NGF之间均存在显著差异性（P<0.01）。在DN组NGF注入糖尿病大鼠左侧星状神经节内后,左室近、远端TH阳性神经纤维密度和相应的TH mRNA以及NGF蛋白水平均较DM组显著升高（P<0.01）,且近、远端之间比较差异均无显著性（P>0.05）。同时NGF干预后DN组大鼠QTc和QTcd均比DM组显著缩短（P<0.01）,程序电刺激实验中室性心律失常的诱发率较DM组显著减少（15.38%vs.46.15%,P<0.01）,与正常对照组比较差异无显著性（15.38%vs.7.14%,P>0.05）。结论：DCAN可引起心脏左室近、远端NGF水平的不均匀下调,与相应部位交感神经去神经化的不均衡程度相吻合。心脏交感神经的不均衡支配可增加心脏电生理异质性,并导致心律失常易感性的增加。NGF干预可促进糖尿病大鼠心脏交感神经再生,纠正DCAN导致的交感神经支配失衡,降低心脏电生理异质性及室性心律失常的易感性。第二部分骨髓间充质干细胞移植对糖尿病心脏自主神经病变及电生理的影响及其机制目的：探讨MSCs移植对糖尿病心脏自主神经病变的修复作用及其可能机制,为糖尿病心脏自主神经病变提供新的治疗手段及理论依据。材料与方法：选取4周左右Wistar大鼠股骨及胫骨分离MSCs,传代后冻存备用。30只糖尿病成模大鼠被随机分成为3组（每组10只）：DM组；DM+MSC治疗组；DM+MSC条件培养基组。另外10只非糖尿病大鼠被作为空白对照组。糖尿病成模16周后开胸行MSCs心肌内移植。MSCs移植2周后利用小动物无线遥测系统分析心率变异性,随后所有大鼠行程序电刺激诱发室性心律失常。电生理实验结束后处死大鼠,立即取左室心肌组织。采用免疫组织化学法检测生长相关蛋白43（growth associated protein43, GAP43）、胆碱乙酰转移酶（holine acetyltransferase, ChAT）和酪氨酸羟化酶化酶（tyrosine hydroxylase, TH）阳性神经纤维在心肌的表达及分布情况。为明确旁分泌作用部分介导了MSCs促进心脏自主神经再生作用,在本实验中,我们提取MSCs培养的上清并注射入心肌,利用ELISA试剂盒检测MSCs培养上清中NT-3和NGF的含量,并与单纯细胞培养基组进行对比分析。结果：与单纯DM组相比,MSCs移植组大鼠心脏左室GAP43、TH、ChAT阳性神经纤维密度均显著增加（P<0.05,P<0.01）,且ChAT/TH阳性纤维比例提高（0.37±0.014vs0.27±0.020,P<0.01）,提示MSCs移植后可促进心脏自主神经再生,且可增加迷走神经支配比例,恢复心脏迷走与交感神经支配的平衡;MSCs移植2周后,利用小动物无线遥测系统行心率变异性分析,与单纯DM组相比,MSCs移植组SDNN.LF.HF等指标均显著增加（P<0.01）,且LF/HF比例显著降低（P<0.01）；电生理实验结果发现MSCs移植组室性心律失常易感性较DM组显著降低（P<0.01）。ELISA试剂盒检测发现MSCs培养上清中NT-3和NGF含量均较单纯细胞培养基组显著增加（P<0.01）,提示MSCs分泌的神经营养因子是促进心脏自主神经再生的重要因素。在实验过程中,MSCs心肌移植后未发现致瘤现象,初步证实了MSCs移植治疗糖尿病心脏自主神经病变的安全性。结论：MSCs心肌内移植后,除了促进糖尿病心脏自主神经再生外,还可增加迷走神经比例,改善糖尿病造成的迷走神经与交感神经的失衡状态,降低室性心律失常易感性。
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