谷胱甘肽高产酵母菌的选育及其产物的分离纯化

论文摘要

谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是一种由具有重要生理功能的活性三肽，它是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成。GSH在食品、医学、保健、抗衰老等方面具有广泛的应用。本文对高产GSH酵母菌的选育、培养条件优化及GSH的分离纯化进行了研究。从30株不同种属的酵母中确定德国果酒酵母为诱变出发菌株，其菌体干重为4.67g/L、胞内GSH含量为6.51mg/g和GSH产量为30.40g/L。并对其原生质体制备的最佳条件进行了研究。利用UV-HNO2复合诱变处理GSH生产菌株的原生质体，筛选得到S.cerevisiaeYZM-14（ZnCL2r,Cysr），其GSH产量（84.72mg/L）、菌体干重（7.63g/L）及胞内GSH含量（11.10mg/g）分别比出发菌株提高了178%、63.38%和70.51%，且性状稳定。S.cerevisiaeYZM-14与出发菌株相比PP途径代谢通量增加8.1%，GSH前体合成途径通量增加，且诱变菌株的琥珀酸分泌通量减少，提高了细胞的碳源利用效率，增加了GSH的生成。运用响应面分析法对S.cerevisiae YZM-14合成GSH的摇瓶发酵培养基和培养条件进行了优化，结果为：葡萄糖浓度为2.544%，酵母膏浓度为1.033%、初始pH为5.88、（NH4）2SO4浓度为0.5%、装液量为50mL/250mL、发酵温度为28℃、MgSO4·7H2O浓度为0.1%、KH2PO4浓度0.1%、发酵时间36h，GSH产量为125.42mg/L比无机发酵培养基GSH产量提高了75.37%。半胱氨酸为关键前体氨基酸，确定了添加浓度为0.4%，胞内GSH含量和GSH产量分别提高到16.06mg/g和161.23mg/L。乙醇提取胞内GSH的条件为乙醇浓度40%、提取时间120min、料水比20mL（水）/g（干细胞）。GSH水溶液的合适保存pH为3.0。运用001×7（732）强酸型阳离子交换树脂对酵母细胞提取液进行梯度分离提纯GSH，此方法减少了洗脱体积和提高了GSH的纯度，经分离提纯后GSH的回收率为61.15%，纯度为84.71%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 谷胱甘肽的结构与性质
• 1.1.1 谷胱甘肽的结构
• 1.1.2 谷胱甘肽的性质
• 1.2 谷胱甘肽的生物合成
• 1.3 谷胱甘肽的生理功能与应用
• 1.3.1 谷胱甘肽的生理功能
• 1.3.2 谷胱甘肽的应用
• 1.4 国内外谷胱甘肽的生产方法及研究现状
• 1.5 发酵法生产谷胱甘肽
• 1.5.1 谷胱甘肽高产菌株选育
• 1.5.2 发酵培养基及培养条件优化
• 1.6 谷胱甘肽的提取及分离纯化
• 1.6.1 胞内谷胱甘肽的提取
• 1.6.2 谷胱甘肽的分离纯化
• 1.6.3 离子交换法分离纯化谷胱甘肽
• 1.6.4 离子交换法纯化谷胱甘肽存在的问题
• 1.7 代谢通量分析
• 1.7.1 代谢工程
• 1.7.2 代谢通量分析计算方法
• 1.8 本课题的主要研究内容
• 第二章 高产谷胱甘肽酵母菌的初筛及其原生质体制备
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 缓冲液、预处理剂和酶液
• 2.1.4 药品与试剂
• 2.1.5 仪器与设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 分析方法
• 2.2.2 培养方法
• 2.2.3 高产谷胱甘肽酵母菌株的初筛
• 2.2.4 酵母菌的原生质体的制备与再生
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 谷胱甘肽检测方法
• 2.3.2 高产谷胱甘肽酵母菌的初筛
• 2.3.3 德国果酒酵母的原生质体制备与再生
• 2.4 小结
• 第三章 复合诱变筛选高产谷胱甘肽酵母菌及其代谢通量分析
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 缓冲液、预处理剂和酶液
• 3.1.4 药品与试剂
• 3.1.5 仪器与设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 分析方法
• 3.2.2 培养方法
• 2复合诱变筛选高产谷胱甘肽酵母菌'>3.2.3 UV-HNO₂复合诱变筛选高产谷胱甘肽酵母菌
• 3.2.4 谷胱甘肽生产菌株的代谢通量分析
• 3.3 结果与讨论
• 2复合诱变筛选高产谷胱甘肽酵母菌'>3.3.1 UV-HNO₂复合诱变筛选高产谷胱甘肽酵母菌
• 3.3.2 谷胱甘肽生产菌株代谢通量分析
• 3.4 小结
• 第四章 高产谷胱甘肽酵母菌的发酵条件优化
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 药品与试剂
• 4.1.4 仪器与设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 分析方法
• 4.2.2 高产谷胱甘肽酵母菌的培养基和培养条件优化
• 4.2.3 前体氨基酸对谷胱甘肽生物合成的影响
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 培养基和培养条件的单因素试验
• 4.3.2 Plackett-Burman 试验设计法筛选重要因素
• 4.3.3 最陡爬坡试验
• 4.3.4 响应面分析法优化发酵条件
• 4.3.6 前体氨基酸对谷胱甘肽生物合成的影响
• 4.4 小结
• 第五章 胞内谷胱甘肽的提取及其分离纯化
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 药品与试剂
• 5.1.3 仪器与设备
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 谷胱甘肽的测定方法
• 5.2.2 乙醇提取酵母胞内谷胱甘肽
• 5.2.3 pH 的水溶液对谷胱甘肽稳定性影响
• 5.2.4 树脂的预处理
• 5.2.5 静态吸附试验
• 5.2.6 谷胱甘肽的吸附和洗脱
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 乙醇提取胞内谷胱甘肽
• 5.3.2 pH 的水溶液对谷胱甘肽稳定性影响
• 5.3.3 静态吸附试验
• 5.3.4 洗脱流速对洗脱效果的影响
• 4Cl 浓度对谷胱甘肽分离纯化的影响'>5.3.5 NH₄Cl 浓度对谷胱甘肽分离纯化的影响
• 5.3.6 梯度洗脱分离纯化谷胱甘肽
• 5.3.7 谷胱甘肽分离纯化效果 HPLC 检测
• 5.4 小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 附录
• 硕士期间研究成果
• 致谢