VEGF受体结合抑制肽的人工合成、原核表达及其活性分析

论文摘要

目的:通过人工合成VEGF受体结合抑制7肽、基因重组表达VEGF受体结合抑制7肽与硫氧还蛋白（Trx）的融合蛋白Trx-RBIP,分析其生物学活性,探讨它们作为抗肿瘤血管新生药物的前景。 方法:利用噬菌体展示技术获得的VEGF受体结合抑制7肽的氨基酸序列,人工合成该多肽,通过细胞培养阻断实验检测其对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的抑制作用。将该短肽的基因插入质粒pET-32 a（+）,与硫氧还蛋白（Trx）在大肠杆菌BL21（DE3）中融合表达;表达产物经过DEAE阴离子交换柱纯化后用肠激酶酶切;酶切产物利用6×His纯化标签,通过Ni柱亲和层析纯化;通过细胞阻断实验检测目的蛋白Trx-RBIP对HUVEC的抑制效果。 结果:人工合成受体结合抑制7肽与VEGFR有良好结合的能力,呈剂量依赖性抑制VEGF促HUVEC增殖的作用,最高抑制率达56.2%。成功构建表达载体pET-32a（+）TrxRBIP,并成功在大肠杆菌BL21（DE3）中获得高效胞内可溶性表达,表达的目的蛋白占细菌总蛋白的42%;DEAE阴离子交换层析纯化获得高纯度的产物,经肠激酶酶切获得到抑制肽N端游离的融合蛋白Trx-RBIP。Ni离子亲和柱层析纯化获得纯度较高的Trx-RBIP蛋白。细胞培养方法检测显示其对细胞HUVEC有良好的抑制作用,抑制效率可达24.9%。 结论:人工合成VEGF受体结合抑制肽及其硫氧还蛋白的融合蛋白Trx-RBIP,均能竞争结合VEGFR,阻断VEGF-VEGFR信号传导,抑制VEGF促HUVEC增殖的作用,具有进一步开发应用的前景。

论文目录

• 缩略语
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 前言
• 1.1 血管新生与肿瘤
• 1.2 血管内皮细胞生长因子VEGF的生物学特性
• 1.3 小分子抑制肽的现状和前景
• 1.4 噬菌体展示技术获得具有受体抑制活性多肽
• 1.5 小分子药物的缺陷与改良
• 1.6 前期工作基础与实验策略
• 1.7 本实验技术路线
• 第二部分 人工合成VEGF受体结合抑制肽的生物学功能检测
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 HUVEC培养条件的优化
• 2.2.2 人工合成VEGF受体结合抑制肽对HUVEC生长的抑制作用
• 2.3 实验结果与分析
• 2.4 讨论
• TRX_RBIP的构建及其表达'>第三部分 表达载体PET-32A（+）_TRX_RBIP的构建及其表达
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• Trx的构建'>3.2.1 载体pET-32a（+）_Trx的构建
• Trx_RBIP的构建'>3.2.2 受体结合抑制肽基因的合成和表达载体pET-32a（+）_Trx_RBIP的构建
• Trx_RBIP在大肠杆菌中的表达'>3.2.3 质粒pET-32a（+）_Trx_RBIP在大肠杆菌中的表达
• 3.3 实验结果及分析
• 3.4 讨论
• 第四部分 表达产物的纯化及活性分析
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 DEAE阴离子交换纯化表达产物
• 4.2.2 肠激酶酶切表达产物
• 2+亲和层析纯化及Western Blotting检测'>4.2.3 Ni²⁺亲和层析纯化及Western Blotting检测
• 4.2.4 目的产物Trx-RBIP对HUVEC细胞增殖的抑制作用检测
• 4.3 实验结果及分析
• 4.4 讨论
• 第五部分 实验总结、讨论与展望
• 5.1 实验总结
• 5.2 讨论
• 5.2.1 肿瘤疫苗的探讨
• 5.2.2 抗肿瘤血管新生药物
• 5.2.3 肿瘤血管新生需解决的机理问题
• 5.3 展望
• 参考文献
• 在学期间完成论文及参加学术会议
• 致谢