结球甘蓝和青花菜游离小孢子培养技术的优化

论文摘要

结球甘蓝（Brassica oleracea var.capitata）和青花菜（Brassica oleracea var. italica）均属于十字花科（Cruciferae）芸薹属（Brassica）二年生草本植物。二者均具有相当广泛的自交不亲和性,在杂交种亲本系的常规选育中要多年蕾期自交。用常规方法进行田间育种,一般需要6～8代才能选育出理想的材料。通过游离小孢子培养得到的植株经染色体加倍后,能获得遗传上完全纯合的后代。这不仅可大大缩短杂交育种工作中自交系选育进程,而且对新品种的选育和种质资源的开发起到非常大的作用。目前国内外有很多关于游离小孢子培养的报道,技术也越来越成熟,但小孢子基因型间产胚率差异大及植株再生率低已成为实际应用当中的一大难题；另外,在进行倍性鉴定时,缺乏一种简便、经济、实用而又可靠的倍性鉴定方法。因此,本论文通过对选取的17份不同类型结球甘蓝和10份不同类型青花菜杂种一代为试材,对影响小孢子产胚率和植株再生率的因素、小孢子再生植株染色体倍性的鉴定、小孢子再生植株群体的自然加倍率和单倍体植株的人工加倍方法进行了研究。得出以下结果：1.在影响甘蓝和青花菜游离小孢子胚胎诱导率的因素方面：（1）不同基因型材料最适花蕾长度有一定差异,结球甘蓝和青花菜分别在3.5～4.5mmm和3.0～3.5mm时,小孢子大多处于单核靠边期,获得的胚状体最多；（2）不同基因型之间小孢子产胚率有很大差异；（3）获得高效小孢子胚状体的温度及培养基pH值最佳组合分别为：结球甘蓝：33℃热激2d+培养基pH6.2；青花菜：4℃低温1d+33℃热激1d+培养基pH6.2。（4）在提取液中加入8%甘露醇有助于结球甘蓝和青花菜小孢子胚胎发生；（5）前期用17%的高糖培养基培养2d后更换为新的13%蔗糖培养基对小孢子产胚率也有促进作用；（6）激素含量对小孢子胚状体的诱导的作用差异很大。NLN-13+0.05mg·L-16-BA+0.1g-L-1NAA有助于结球甘蓝小孢子胚胎诱导；而1/2NLN-13培养基对青花菜小孢子胚胎发生率有促进作用。（7）预处理是小孢子培养成功的前提条件。试验表明,低温处理2d、8%甘露醇、适宜浓度的CH和秋水仙素都能提高结球甘蓝小孢子的胚胎诱导率。2.在影响游离小孢子胚状体再生成植株的因素方面：（1）7.0g.L-1琼脂浓度的B5固体培养基最适合小孢子胚状体的萌发和植株再生,且子叶胚再生植株的频率高于非子叶胚；（2）在固体培养基中培养25d的子叶胚转到再生培养基后成苗率较高；（3）培养基中加入4.0～5.0mg.L-1的AgNO3能有效解决胚状体再生植株褐化、玻璃化等现象；3.通过对结球甘蓝和青花菜小孢子再生植株的染色体倍性与气孔保卫细胞叶绿体数之间的相关性进行研究,得出孔保卫细胞叶绿体数少于或等于10个的为单倍体,大于10而少于或等于15个的为二倍体,大于15个的为多倍体。经几种染色体加倍技术的对比处理后得知,在游离小孢子培养阶段,在液体培养基中加入一定浓度的秋水仙素对小孢子再生植株的染色体加倍效果最好。因此,本试验明确了影响小孢子胚胎发生率及植株再生率的影响因子；获得了一种快速、准确的倍性鉴定方法一叶绿体数倍性分界法；通过对几种染色体加倍技术的比较,找出了一种加倍效率高的方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 縮略词
• 第一章 文献综述
• 1.1 结球甘蓝和青花菜的生物学特性
• 1.2 植物单倍体育种的研究
• 1.2.1 单倍体的概念
• 1.2.2 单倍体的产生与意义
• 1.3 甘蓝类蔬菜游离小孢子培养体系的研究
• 1.3.1 游离小孢子培养的基本概念
• 1.3.2 离体培养条件下小孢子的发育进程
• 1.3.3 甘蓝类蔬菜游离小孢子培养的研究概况
• 1.3.4 花药培养和游离小孢子培养的区别
• 1.3.5 游离小孢子培养的意义
• 1.3.6 游离小孢子胚状体再生植株
• 1.3.7 染色体加倍技术
• 1.4 问题与展望
• 第二章 结球甘蓝和青花菜小孢子胚胎诱导率的研究
• 第一节 培养基、温度及PH处理对结球甘蓝和青花菜小孢子胚胎发生率的研究
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 试验材料
• 1.1.2 试验方法
• 1.2 结果与分析
• 1.2.1 小孢子发育时期与花蕾大小的关系
• 1.2.2 不同基因型对结球甘蓝和青花菜小孢子胚胎发生率的影响
• 1.2.3 高温热激结合NLN-13培养基pH值对结球甘蓝胚胎发生率的影响
• 1.2.4 培养基pH值对青花菜小孢子胚胎发生率的影响
• 1.2.5 低温与高温热激时间组合对青花菜小孢子胚胎发生率的影响
• 1.2.6 提取液中甘露醇浓度对结球甘蓝和青花菜小孢子胚胎发生率的影响
• 1.2.7 不同激素种类及浓度对结球甘蓝和青花菜小孢子胚胎发生率的影响
• 1.2.8 更换培养基对结球甘蓝和青花菜小抱子胚胎发生率的影响
• 1.3 讨论
• 1.3.1 小孢子发育时期与花蕾大小的关系
• 1.3.2 基因型对结球甘蓝和青花菜小孢子胚胎发生率的影响
• 1.3.3 温度及pH值对结球甘蓝和青花菜小孢子胚胎发生率的影响
• 1.3.4 提取液中甘露醇浓度对结球甘蓝和青花菜小孢子胚胎发生率的影响
• 1.3.5 不同激素种类及浓度对结球甘蓝和青花菜小孢子胚胎发生率的影响
• 1.3.6 更换培养基对结球甘蓝和青花菜小孢子胚胎发生率的影响
• 第二节 预处理对结球甘蓝游离小孢子培养力的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.1.3 结果统计
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 4℃低温预处理对甘蓝游离小孢子培养力的影响
• 2.2.2 不同浓度甘露醇对甘蓝小孢子培养力的影响
• 2.2.3 不同浓度的CH对甘蓝小孢子培养力的影响
• 2.2.4 不同浓度秋水仙素对甘蓝小孢子培养力的影响
• 2.3 讨论
• 第三章 结球甘蓝和青花菜小孢子植株再生率的研究
• 3.1 方法与结果统计
• 3.1.1 试验方法
• 3.1.2 结果统计
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 转胚时间对固体培养基上青花菜小孢子胚状体成活率的影响
• 3.2.2 琼脂浓度对结球甘蓝和青花菜小孢子再生苗玻璃化的影响
• 3.2.3 不同类型的胚再生植株频率的差异
• 3含量对子叶胚再生成植株的影响'>3.2.4 B5固体培养基中AgNO₃含量对子叶胚再生成植株的影响
• 3.2.5 继代培养过程中MS培养基添加剂对胚状体再生植株率的影响
• 3.3 讨论
• 第四章 结球甘蓝和青花菜小孢子再生植株倍性鉴定方法的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 不同倍性间小孢子植株的形态特征
• 4.2.2 染色体倍性与气孔保卫细胞叶绿体数的关系
• 4.3 讨论
• 第五章 结球甘蓝和青花菜小孢子再生植株染色体加倍技术研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 试验方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 染色体自然加倍
• 5.2.2 培养过程中加倍
• 5.2.3 移栽前加倍
• 5.2.4 不同加倍方法间的比较
• 5.3 讨论
• 创新之处
• 后续工作
• 参考文献
• 附录
• 论文发表
• 致谢