牛IgG2 Fc受体胞外区的克隆、表达、复性及晶体的生长

论文摘要

Fc受体（FcR）是一类重要的免疫细胞表面分子。它不仅赋予免疫细胞杀伤病毒与细菌、清除免疫复合物、溶解癌变细胞的能力,而且参与免疫反应的启动与调节。IgG Fc受体（Fc γ R）是Fc受体中最重要的一种。而牛IgG2 Fc受体（boFc γ 2R）是一类新型哺乳动物Fc受体,反刍动物IgG在抗传染免疫中具有超级免疫作用。因此,研究牛IgG2 Fc受体的三维结构可以阐述其结构和功能的关系,以便我们更好的理解其在体内的作用机理。 本试验的目的是通过反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法,克隆和表达出牛IgG2 Fc受体（boFc γ 2R）的胞外环区（EC区）,并初步筛选出晶体生长的条件,为最终用X-射线方法解出晶体结构,从三维空间结构上阐述牛Fc γ 2R在牛的超级免疫中发挥作用的机理打下基础。 根据张改平博士在Genbank中注册的牛Fc γ 2R的基因（Z37506）核苷酸序列设计并合成了一对引物B11、B12,以提取的健康成年牛的白细胞总RNA作为模板,以RT-PCR法扩增出682bp的片段,经酶切鉴定后,将该片段克隆入pGEM-T Easy Vector System Ⅰ中进行序列测定。经序列分析发现,所扩增EC区的核苷酸序列与Genbank中注册的牛Fc γ 2R的基因的同源性为100%。 将牛Fc γ 2R的EC区和原核表达载体pET-28a（+）分别用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切,回收的牛Fc γ 2R EC区定向克隆于回收的pET-28a（+）大片段中,筛选出阳性重组质粒,经IPTG诱导表达,所得产物经SDS-PAGE电泳,dot-ELISA,结果表明得到了特异性的牛Fc γ 2R的EC区蛋白。 本试验通过对目的蛋白包涵体的变性、复性和纯化,得到了较纯的特异性的牛Fc γ 2R的EC区蛋白,并得到了晶体,筛选出了晶体生长的条件,从而为最终从三维空间结构上阐述牛Fc γ 2R在牛的超级免疫中发挥作用的机理打下基础。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 1 文献综述
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 4 结果与分析
• 4.1 总RNA提取结果
• 4.2 RT-PCR结果
• 4.3 梯度PCR结果
• 4.4 RT-PCR产物回收结果
• 4.5 EC区片段与T载体的连接产物双酶切鉴定结果
• 4.6 原核表达载体的鉴定结果
• 4.7 EC区测序结果及其推导的氨基酸序列
• 4.8 SDS-PAGE电泳结果
• 4.9 Dot-ELISA
• 4.10 包涵体复性蛋白的纯化结果
• 4.11 晶体的生长结果
• 5 结论与讨论
• 5.1 牛白细胞的提取
• 5.2 引物设计
• 5.3 RNA酶的处理
• 5.4 影响RT-PCR的两个关键因素
• 5.5 影响SDS-PAGE结果的两个关键因素
• 5.6 关于克隆载体的连接
• 5.7 关于表达载体的连接
• 5.8 关于EC区的原核表达
• 5.9 关于包涵体的复性
• 5.10 关于晶体的生长
• 5.11 下一步需进行的工作
• 6 全文小结
• 参考文献
• 英文摘要