聚乙二醇化重组人白细胞介素-6的放射性标记分离纯化和生物学活性鉴定

论文摘要

白细胞介素-6（IL-6）是淋巴类及非淋巴类细胞产生的一种多功能细胞因子,在机体免疫、骨髓造血及炎症反应中均能发挥重要作用,是细胞网络中的重要成员。目前以IL-6治疗血小板减少症为目的的研究,在欧美和日本已进入临床试验阶段。但IL-6在体内由于蛋白酶的水解而呈现出低稳定性,同时由于快速的肾排泄和广泛的组织分布其生物半衰期很短。为了达到期望中的临床效果,通常采用高剂量和频繁给药;同时由于其具有广泛的生物学效应,可能产生副作用。 有关研究发现,IL-6经PEG修饰后,分子量增加,肾小球的滤过减少;PEG的屏障作用保护了IL-6不易被蛋白酶水解,同时减少了抗体的产生,这些均有助于IL-6循环半衰期的延长,并保证它促进血小板生成的临床效果。我国有关单位开发的PEG-rhIL-6新型药物也正处于临床前研究阶段。同位素标记示踪法是目前生物技术药物临床前药代动力学研究的主要手段之一,而制备高纯度的同位素标记物是应用该方法进行药代动力学研究的关键和首要条件之一。为使PEG-rhIL-6早日应用于临床,本研究制备出高纯度,比放射性适中,生物活性保持良好的PEG-rhIL-6同位素标记物,为进一步研究PEG-rhIL-6在体内的代谢规律提供必要条件和保证。 本研究选用碘-125作为标记核素,采用双相氯氨T法和常规氯氨T法对聚乙二醇化重组人白细胞介素-6（PEG-rhIL-6）进行放射性碘标记,比较两种方法的标记率、比放射性和对蛋白质生物活性影响;分别用凝胶过滤法和离心超滤法对标记物分离纯化,同时用三氯乙酸沉淀法和SDS-PAGE电泳法鉴定纯化后标记物的放化纯度;采用rhIL-6依赖细胞7TD1,用MTT比色法测定标记物的生物学活性;初步探讨了温度和保护蛋白对标记蛋白的储存稳定性影响。得到的结果如下: 1.用双相氯氨T方法对PEG-rhIL-6进行放射性碘标记,标记率为74.5%,比放射性为5.513×105Bq/ug,三氯乙酸沉淀法鉴定经过柱层析和超滤离心纯化后标记物的放化纯度>99%,SDS-PAGE法鉴定标记物与标准品电泳行为一致,有两个电泳条带,Rf值分别为0.289和0.542。 2.用常规氯氨T方法对PEG-rhIL-6进行放射性碘标记,标记率为62.3%,比放射性为4.625×105Bq/ug,三氯乙酸沉淀法鉴定柱层析和超滤离心纯化后标记物的放化纯度>99%,SDS-PAGE法鉴定标记物与标准品电泳行为比较,有三个电泳条带,

论文目录

• 引言
• 1 生物技术药物的发展
• 2 白细胞介素-6的研究概况
• 2.1 IL-6的生物学特性
• 2.2 IL-6的生物学功能
• 2.2.1 生物学效应
• 2.2.2 生物学活性测定
• 2.3 PEG-rhIL-6的发展及现状
• 2.3.1 IL-6的聚乙二醇修饰
• 2.3.2 PEG-rhIL-6的临床应用
• 3 生物技术药物的药代动力学研究
• 4 蛋白质多肽药物代谢动力学研究中的标记方法
• 5 标记物的纯化方法
• 6 本试验的目的及意义
• 材料与方法
• 1 药品及试剂
• 2 仪器设备
• 3 技术路线
• 4 PEG-rhIL-6的放射性碘标记
• 4.1 常规氯胺 T法标记
• 4.2 双相氯胺 T法标记
• 5 标记物的分离纯化
• 5.1 柱层析法
• 5.2 离心超滤法
• 6 标记物放化纯度的鉴定
• 6.1 三氯乙酸沉淀法
• 6.2 SDS-PAGE电泳法
• 7 蛋白含量的测定
• 125I-PEG-rhIL-6标记物的影响'>8 储存条件对¹²⁵I-PEG-rhIL-6标记物的影响
• 9 生物学活性鉴定
• 结果与分析
• 1 PEG-rhIL-6放射性碘标记率
• 2 PEG-rhIL-6标一记物比放射性
• 125I-PEG-rhIL-6标记物的分离纯化'>3¹²⁵I-PEG-rhIL-6标记物的分离纯化
• 3.1 柱层析法
• 3.2 离心超滤法
• 4 放化纯度鉴定
• 4.1 三氯乙酸沉淀法
• 4.2 SDS-PAGE电泳法
• 4.2.1 SDS-PAGE法比较标记物与标准品电泳行为
• 4.2.2 SDS-PAGE电泳法测定放化纯
• 5 蛋白含量
• 5.1 标准曲线
• 5.2 蛋白回收率
• 125I-PEG-rhIL-6标记物的影响'>6 储存条件对¹²⁵I-PEG-rhIL-6标记物的影响
• 6.1 储存条件对标记物放化纯度的影响
• 6.2 储存条件对标记物分子结构的影响
• 7 生物学活性鉴定
• 讨论
• 1 蛋白质多肽的碘标记方法
• 2 标记蛋白的分离纯化
• 3 放化纯度鉴定
• 4 蛋白定量
• 5 生物活性鉴定
• 6 标记物保存稳定性鉴定
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 发表的学术论文目录