玉米WRKY转录因子基因的克隆及耐逆性研究

论文摘要

WRKY转录因子主要存在于植物中，其家族成员广泛参与植物生长发育、代谢以及对生物和非生物胁迫的反应。本研究利用逆境因子ZmWRKY33,ZmWRKY57和ZmWRKY62基因进行胁迫诱导，在此基础上从玉米中克隆这三个WRKY基因,并对其耐逆性功能进行了初步的研究。结果如下：1.利用逆境因子干旱、高盐和低温对ZmWRKY33，ZmWRKY57和ZmWRKY62三个基因进行诱导表达分析，结果显示三个基因均受逆境因子干旱、高盐和低温的诱导表达。2.克隆了三个玉米WRKY基因，ZmWRKY33，ZmWRKY57和ZmWRKY62。它们分别编码307个氨基酸残基、311个氨基酸残基和306个氨基酸残基，都有1个高度保守的WRKY结构域，锌指结构域都为典型的C2H2。3.构建了过表达载体（p-ZmWRKY33）,利用农杆菌介导的方法转化晚晴粳稻愈伤，获得20株T0代过表达株系。T1代过表达株系的耐逆性功能研究表明，Z mWRKY33具有增强水稻耐干旱、高盐和低温的耐受性。4.通过构建融合表达载体PRTL2-ZmWRKY33-mGFP，PRTL2-ZmWRKY57-mGF-P和PRTL2-ZmWRKY62-mGFP,采用基因枪法轰击洋葱表皮细胞进行亚细胞定位分析，结果显示ZmWRKY33,ZmWRKY57和ZmWRKY62与GFP载体的融合蛋白都定位于细胞核中，说明ZmWRKY33，ZmWRKY57和ZmWRKY62蛋白都具有转录因子的核定位信号特征。5.构建了过表达载体（p-ZmWRKY57（bar+）和p-ZmWRKY62（bar+））和双链RNAi载体(p1301（2ZmWRKY57i-bar+）和p1301（2ZmWRKY62i-bar+）,转化农杆菌,可用于下一步玉米转化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 文献综述
• 1.1 植物在非生物逆境下的应答反应
• 1.2 植物转录因子的研究进展
• 1.2.1 转录因子的结构与功能
• 1.2.2 转录因子的分类
• 1.2.3 转录因子的生物学功能
• 1.3 植物 WRKY 转录因子家族的研究进展
• 1.3.1 WRKY 转录因子的起源
• 1.3.2 WRKY 结构域（WRKY domain）及 W 盒（w-box）
• 1.3.3 WRKY 转录因子的生物学功能
• 1.3.4 WRKY 转录因子的调控机制
• 2 引言
• 2.1 研究的目的与意义
• 2.2 技术路线
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 载体与菌株
• 3.1.3 酶及试剂
• 3.2 WRKY 基因的逆境处理表达分析
• 3.2.1 植物材料与处理
• 3.2.2 RT-PCR 反应所用引物
• 3.2.3 Trizol 法提取 RNA
• 3.2.4 反转录获得 cDNA，作为模版做 RT-PCR（promega 反转录试剂盒）
• 3.3 WRKY 基因的克隆与载体的构建
• 3.3.1 WRKY 基因的克隆
• 3.3.2 p-ZmWRKY33 过表达载体的构建
• 3.3.3 ZmWRKY57 和 ZmWRKY62 基因的过表达载体的构建
• 3.3.4 ZmWRKY57 和 ZmWRKY62 基因的干涉表达载体的构建
• 3.4 转化农杆菌
• 3.5 ZmWRKY33 转基因水稻的获得与检测
• 3.5.1 侵染水稻愈伤组织
• 3.5.2 阳性转基因水稻苗的获得
• 3.5.3 ZmWRKY33 阳性转基因植株的检测
• 1 代植株的耐逆性鉴定'>3.6 ZmWRKY33 转基因 T₁代植株的耐逆性鉴定
• 1 代植株的耐旱性鉴定'>3.6.1 ZmWRKY33 转基因 T₁代植株的耐旱性鉴定
• 1 代植株的耐盐性鉴定'>3.6.2 ZmWRKY33 转基因 T₁代植株的耐盐性鉴定
• 1 代植株的耐冷性鉴定'>3.6.3 ZmWRKY33 转基因 T₁代植株的耐冷性鉴定
• 1 代植株的表达分析'>3.7 ZmWRKY33 转基因 T₁代植株的表达分析
• 3.8 ZmWRKY33，ZmWRKY57 和 ZmWRKY62 的亚细胞定位
• 3.8.1 构建含功能基因的融合表达载体
• 3.8.2 洋葱（Allium cepa）表皮的基因枪转化
• 4 结果与分析
• 4.1 ZmWRKY33，ZmWRKY57 和 ZmWRKY62 基因的逆境处理表达分析
• 4.2 ZmWRKY33，ZmWRKY57 和 ZmWRKY62 的克隆及序列分析
• 4.3 表达载体的构建
• 4.3.1 ZmWRKY33 过表达载体的构建
• 4.3.2 ZmWRKY57 过表达载体的构建
• 4.3.3 ZmWRKY57 干涉载体的构建
• 4.3.4 ZmWRKY62 过表达载体的构建
• 4.3.5 ZmWRKY62 干涉载体的构建
• 4.4 ZmWRKY33 转化水稻及阳性转基因植株的检测
• 1 代植株的耐逆性鉴定'>4.5 ZmWRKY33 转基因 T₁代植株的耐逆性鉴定
• 1 代植株的耐旱性鉴定'>4.5.1 ZmWRKY33 转基因 T₁代植株的耐旱性鉴定
• 1 代植株的耐盐性鉴定'>4.5.2 ZmWRKY33 转基因 T₁代植株的耐盐性鉴定
• 1 代植株的耐冷性鉴定'>4.5.3 ZmWRKY33 转基因 T₁代植株的耐冷性鉴定
• 1 代植株的表达分析'>4.6 ZmWRKY33 转基因 T₁代植株的表达分析
• 4.7 ZmWRKY33，ZmWRKY57 和 ZmWRKY62 的亚细胞定位分析
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
• 攻读硕士期间的研究成果