论文摘要
目的:探讨应用SPDP蛋白交联法制备TAT-EGFP（穿膜肽-增强型绿色荧光蛋白）-抗体（抗HBsAg-IgG）-蛋白微球（BSA-NS）三联偶联物（TAT-EGFP-IgG-BSA-NS）的可行性,并鉴定该三联偶联物的化学成分、偶联方式及穿膜活性;为后续构建对肿瘤细胞的杀伤效应同时具备安全性、靶向性、特异性和高效性的穿膜肽-肿瘤特异性抗体-药物微球（包裹药物的白蛋白微球）新型药物传送系统奠定基础。方法:1.大量表达融合蛋白TAT-EGFP并进行鉴定:参照本课题组前期实验方法,复苏实验室保存的高表达融合蛋白TAT-EGFP的表达菌株——大肠杆菌BL21,提取质粒,进行基因序列测定验证其目的质粒的序列组成;大量诱导表达融合蛋白TAT-EGFP,并用镍亲和层析法进行蛋白纯化,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法（SDS-PAGE）鉴定其纯度及分子量大小;用标准蛋白BCA法测定TAT-EGFP的浓度;将TAT-EGFP与EJ细胞（膀胱癌细胞系）共孵育,荧光显微镜下观察融合蛋白TAT-EGFP的穿细胞膜活性。2.制备穿膜肽-蛋白微球二联偶联物:用异型双功能交联剂N-羟基琥珀酰亚胺基-3-（2-吡基二硫）-丙酸酯（SPDP）通过化学交联的方法制备TAT-EGFP与蛋白微球（BSA-NS）的二联偶联物TAT-EGFP-BSA-NS;用SDS-PAGE法检测二联偶联物的化学连接方式及二联偶联物成分;将二联偶联物与EJ细胞共孵育,荧光显微镜下观察二联偶联物的穿细胞膜活性。3.制备穿膜肽-抗体-蛋白微球三联偶联物:用与2相同的方法制备TAT-EGFP、抗HBSAg-IgG与蛋白微球（ BSA-NS ）的三联偶联物TAT-EGFP-IgG-BSA-NS;4.TAT-EGFP、抗体与蛋白微球三联偶联物的鉴定:用SDS-PAGE法检测三联偶联物的连接方式及化学组成;用拉曼光镊显微镜系统（拉曼光镊技术）鉴定三联偶联物的化学成分;用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）进一步鉴定三联偶联物的蛋白微球及TAT-EGFP成分;用间接免疫荧光法进一步鉴定三联偶联物中的抗体成分;将三联偶联物与EJ细胞共孵育,荧光显微镜下观察三联偶联物的穿细胞膜活性。结果:1.融合蛋白TAT-EGFP的表达与鉴定结果:序列测定结果显示扩增的TAT-EGFP基因与预期目的序列一致; SDS-PAGE可见纯化后的蛋白无明显杂带,分子量大小约为31kd左右;标准蛋白BCA法测定的TAT-EGFP的浓度为14.2mg/ml;在激发波长为450nm-490nm的荧光显微镜下,可见与融合蛋白TAT-EGFP共孵育1小时的EJ细胞内有绿色荧光显示。2.二联偶联物的制备与鉴定结果:还原型SDS-PAGE电泳可见在低分子量端形成一条蛋白条带,非还原型SDS-PAGE电泳未见条带;在激发波长为450nm-490nm的荧光显微镜下,可以看到与二联偶联物共孵育1小时的EJ细胞内有绿色荧光显示。3.三联偶联物的制备及鉴定结果:还原型SDS-PAGE电泳可见在低分子量端形成三条蛋白条带,非还原型SDS-PAGE电泳未见条带;非变性聚丙烯酰胺凝胶在紫外凝胶成像仪下,可见加样孔底部有白色显示且未跑进分离胶;光镊拉曼光谱显示三联偶联物较蛋白微球有一些峰变化,并且这些峰在抗体和TAT-EGFP纯品的拉曼光谱上能找到对应的峰;不同激发波长的荧光显微镜下,均可见微球表面分别发出绿色荧光和红色荧光;在激发波长为450nm-490nm的荧光显微镜下,可以看到与三联偶联物共孵育1小时的EJ细胞内有绿色荧光显示。结论:成功应用SPDP蛋白交联法制备穿膜肽-抗体-蛋白微球三联偶联物TAT-EGFP-IgG-BSA-NS,并证明三联偶联物具有穿膜活性;为后续构建穿膜肽-肿瘤特异性抗体-药物微球的新型偶联药物传送系统奠定了基础。确定了用SPDP蛋白交联法以抗体作为连接载体,将穿膜肽和蛋白微球连到抗体上构建穿膜肽-抗体-蛋白微球三联偶联物（TAT-EGFP-IgG-BSA-NS）是可行的、较为理想的连接方案。首次应用拉曼光镊显微镜系统鉴定蛋白偶联物的成分,其结果与SDS-PAGE法、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法、间接免疫荧光法等经典方法鉴定结果一致,确定了拉曼光镊显微镜系统进行蛋白偶联物的鉴定是可行的。
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标签：穿膜肽增强型绿色荧光蛋白论文; 蛋白微球论文; 抗体论文; 蛋白连接论文;