论文摘要
新城疫（ND）又称亚洲鸡瘟,是由新城疫病毒（NOV）引起的一种具有高度传染性的病毒性疾病。NDV病毒可引起鸡、火鸡、鸵鸟、鸽子、孔雀及其它野鸟等多种禽类发病。由于用于禽类的ND疫苗并不能完全阻止该病的发生,该病已造成巨大的经济损失。虽然我们对于造成免疫鸡群发生新城疫流行的根本原因尚不明确,但流行毒株的变异很可能是其中的重要因素之一。研究证明,在NDV感染过程中,位于病毒囊膜上的融合蛋白（F蛋白）是病毒穿入细胞,使宿主细胞产生融合和溶血的重要因子,同时也是病毒的主要保护性抗原。正因为如此,F蛋白已经成为研究新城疫基因工程疫苗和DNA疫苗等新型疫苗的首选抗原。为了探索NDV F蛋白抗原表位结构域基因在免疫应答中的作用及其机理,本研究运用分子克隆技术,对NDV F蛋白抗原表位结构域基因分别进行了克隆、表达和免疫原性鉴定。首先,根据GenBank中登录的NDV F48E9株F基因序列和载体pGEX-4T-1,pET-32-a的多克隆位点分别设计5对引物,应用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）从接种NDV F48E9株的鸡胚尿囊液中扩增出相应大小的目的基因片段F509（509bp）、F1（81bp）、F2（108bp）、F3（105bp）、F4（102bp）。应用添加互补性酶切位点的基因工程方法,将抗原表位基因片段F1、F2、F3拼接成多表位串联基因F306（306bp）。将片段F509插入载体pGEX-4T-1中,片段F1、F2、F3、F4、F306插入载体pET-32-a并转化宿主菌BL21,经双酶切鉴定重组质粒pGEX-4T-1/F509和pET-32-a/F306后,对F509和F306的核苷酸序列进行测定。结果表明本研究成功地克隆了NDV F蛋白抗原表位结构域基因及其多表位串联基因。其次,将上述构建成功的原核表达重组质粒pGEX-4T-1/F509、pET-32-a/F1、pET-32-a/F2、pET-32-a/F3、pET-32-a/F4和pET-32-a/F306转化大肠杆菌BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）于37℃诱导培养4h,表达出含有谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的融合蛋白GST-F509和含有组氨酸（His）的融合蛋白His-F1、His-F2His-F3、His-F4、His-F306;对表达条件进行相应的优化,确定了最佳诱导表达时间和诱导剂浓度;对表达蛋白的可溶性进行鉴定,结果表明表达的融合蛋白均以包涵体形式存在;应用优化的原核表达条件对含有质粒pGEX-4T-1/F509、pET-32-a/F1、pET-32-a/F2、pET-32-a/F3、pET-32-a/F4和pET-32-a/F306的BL21菌进行大量诱导表达,通过反复冻融和超声裂解诱导菌,获得浓度较高的GST-F509和His-F1、His-F2His-F3、His-F4、His-F306包涵体蛋白,用十二烷基肌氨酸钠加超声波的方法使包涵体充分溶解,提取了大量的可溶性GST-F509和His-F1、His-F2、His-F3、His-F4、His-F306融合蛋白。最后,通过Western-blot方法,用制备的鼠抗NDV阳性血清分别与获得的融合蛋白反应。结果表明含F蛋白抗原表位结构的融合蛋白GST-F509和His-F1、His-F2、His-F3、His-F306具有良好的反应原性,而不含抗原表位的融合蛋白His-F4则不能发生此特异性反应。利用上述纯化的GST-F509和His-F1、His-F2、His-F3、His-F4、His-F306融合蛋白作为抗原分别免疫小鼠制备鼠抗NDV F基因片段的多克隆抗体。琼脂扩散实验和ELISA实验结果表明制备的抗NDV F蛋白抗原表位结构域基因的多抗具有较高的效价。综上所述,本研究成功地克隆了NDV F蛋白抗原表位结构域基因及其多表位串联基因,构建了原核表达质粒,进行了原核蛋白表达和纯化,对融合蛋白的免疫原性进行初步的鉴定,并制备了效价高、反应性和特异性强的鼠源抗NDV F蛋白抗原表位结构域基因多克隆抗体,为进一步研究NDV F蛋白的表位疫苗奠定基础。