论文题目: 白介素6类细胞因子对成人成肌细胞增殖和分化影响的实验研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 神经生物学
作者: 汪璇
导师: 范明
关键词: 成肌细胞,白介素,白血病抑制因子,睫状神经营养因子,低氧,神经干细胞,细胞增殖,细胞分化
文献来源: 中国人民解放军军事医学科学院
发表年度: 2005
论文摘要: 白介素6类细胞因子家族,调控着细胞的分化、存活、凋亡和增殖,参与多种复杂的细胞过程如抗炎、造血和神经分化等,是一类重要的细胞因子。白介素6(Interleukin-6,IL-6)、白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)和睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophic factor, CNTF)是其中较重要的三种因子,它们对于血液系统和神经系统的影响已经被广泛研究,但在人源成体成肌细胞的增殖和分化中的作用还未见报导。而成肌细胞做为一种能够提供丰富细胞来源的细胞群体,除了在肌肉萎缩等疾病中有重要作用外,由于它们可以自体取材,因此在以神经细胞变性为特征的中枢神经系统退行性疾病如帕金森病中,也具有较大的应用价值。 我们研究所前期的工作已经证实,一定浓度的CNTF可以抑制成肌细胞向成熟骨骼肌分化,而形成具有向多种细胞类型包括神经元分化潜能的更加原始的干细胞。因此,在本实验中,将应用IL-6、LIF和CNTF三种因子处理成人骨骼肌来源的单克隆化的成肌细胞,观察并比较三种因子对成人成肌细胞增值和分化的影响,并初步探讨它们的作用机制,以证实这些细胞因子是否是一类新的成肌细胞增殖和分化调控分子。同时进行成人成肌细胞脑移植的初步实验,验证成肌细胞做为中枢神经系统疾病移植治疗的替代细胞的可能性。 1、原代培养成人成肌细胞体外增殖、传代、冻存与复苏 连续贴壁法筛选获得的成人成肌细胞纯度不高,多混杂有成纤维细胞的干扰;应用96孔培养板进行的细胞单克隆化,使成肌细胞纯度明显增高,成肌细胞标志蛋白—结蛋白(Desmin)染色结果表明,由此获得的成肌细胞是Desmin阳性、纯度一致、稳定的细胞群体。 2、IL-6、LIF、CNTF细胞因子对成人成肌细胞增殖的影响 细胞增殖曲线和流式细胞术检测结果稍有不同,总结两种方法进行的细胞增殖研究,可明确10ng/ml LIF能够明显促进成人成肌细胞的增殖。而IL-6和CNTF的作用不确切。
论文目录:
实验一
摘要
ABSTRACT
1.引言
2.实验材料、仪器和试剂
2.1 实验材料
2.1.1 成肌细胞取材
2.1.2 成肌细胞移植大鼠
2.2 主要仪器
2.2.1 细胞培养和组织鉴定
2.2.2 蛋白定量、Western杂交
2.2.3 细胞移植与动物行为学实验
2.3 主要试剂
2.3.1 细胞培养
2.3.2 抗体及鉴定的靶细胞
2.3.3 Western杂交
2.4 主要试剂的配制
2.4.1 细胞培养和组织缓冲液
2.4.2 Western杂交
3.实验方法
3.1 原代培养成人成肌细胞
3.1.1 成人骨骼肌取材
3.1.2 连续贴壁法筛选成人成肌细胞
3.1.3 成人成肌细胞单克隆培养
3.1.4 单克隆成人成肌细胞增殖、传代、冻存与复苏
3.1.5 单克隆成人成肌细胞分化形成成熟肌管
3.1.6 成人成肌细胞免疫组织化学和免疫荧光鉴定
3.2 IL-6、LIF、CNTF细胞因子对成人成肌细胞增殖的影响
3.2.1 细胞增殖曲线
3.2.2 流式细胞仪检测细胞周期
3.3 IL-6、LIF、CNTF细胞因子对成人成肌细胞分化的影响
3.3.1 肌管融合率计算成肌细胞分化程度
3.3.2 免疫荧光染色检测特异性成肌分化蛋白myogenin和myosin的表达
3.3.3 Western杂交检测调控成肌分化的转录因子MyoD和Myf5的表达情况
3.4 成人成肌细胞移植实验
3.4.1 细胞移植入大鼠纹状体
3.4.2 移植细胞在脑内的存活、迁移和分化
3.5 数据处理和统计学分析
4.实验结果
4.1 原代培养成人成肌细胞体外增殖、传代、冻存与复苏
4.1.1 连续贴壁法筛选成人成肌细胞
4.1.2 成人成肌细胞单克隆培养、筛选和鉴定
4.1.3 单克隆成人成肌细胞纯度的粗略分析
4.1.4 单克隆成人成肌细胞冻存后的复苏
4.2 IL-6、LIF、CNTF细胞因子对成人成肌细胞增殖的影响
4.2.1 记录细胞增殖曲线
4.2.2 流式细胞术检测细胞周期变化
4.3 IL-6、LIF、CNTF细胞因子对成人成肌细胞分化的影响
4.3.1 成人成肌细胞在分化液中成熟分化形成肌管
4.3.2 IL-6、LIF年CNTF对成肌细胞融合分化形成肌管的影响
4.3.3 IL-6、LIF和CNTF对成肌细胞分化标志蛋白myosin和myogenin表达的影响
4.4 IL-6、LIF和CNTF对调控成肌细胞成熟分化的转录因子MyoD／Myf5的影响
4.5 成人成肌细胞移植后在脑内的存活、迁移和分化
5.讨论
5.1 成人成肌细胞单克隆培养
5.2 成人成肌细胞长期传代和增殖
5.3 LIF促进成肌细胞增殖
5.4 LIF和CNTF抑制成肌细胞成熟分化
5.5 成人成肌细胞脑内移植实验
6.结论
7.参考文献
实验二
摘要
ABSTRACT
1.引言
2.实验材料、仪器和试剂
2.1 实验材料
2.2 主要仪器
2.3 主要试剂
2.3.1 动物低氧实验
2.3.2 免疫荧光和免疫细胞／组织化学染色所用一级抗体
2.3.3 免疫荧光和免疫细胞／组织化学染色所用二级抗体
2.3.4 RT-PCR
2.3.5 其他试剂
2.4 主要试剂的配制
2.4.1 动物实验
2.4.2 RT-PCR
3.实验方法
3.1 建立大鼠PD模型
3.1.1 模型制备
3.1.2 模型成功标准Ⅰ—旋转行为测试
3.1.3 模型成功标准Ⅱ—黑质DA能神经元和纹状体DA纤维损伤
3.2 整体低氧实验
3.3 观察动物行为学变化
3.4 新生细胞在脑内的增殖、迁移和分化
3.5 RT-PCR鉴定低氧2周后，纹状体和海马中低氧诱导因子(HIF-1α)的表达
3.5.1 大鼠HIF-1α引物设计
3.5.2 纹状体和海马总RNA的提取
3.5.3 RNA定性与定量鉴定
3.5.4 RT反应
3.5.5 PCR反应
3.5.6 PCR产物检测
3.6 数据处理和统计学分析
4.实验结果
4.1 成功PD模型的筛选
4.2 低氧环境下大鼠状态和体重变化
4.3 低氧条件对PD模型大鼠旋转行为的影响
4.4 低氧环境下成体大鼠脑内新生细胞的增殖与分化
4.5 低氧对纹状体和海马脑区HIF-1α表达的影响
5.讨论
6.参考文献
附录：文章缩略词一览表
致谢
发布时间: 2005-11-28
参考文献
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