转谷氨酰胺酶基因的克隆表达及发酵条件优化

论文摘要

素有“超级粘合剂”之称的转谷氨酰胺酶作为一种新型的食品添加剂,大大改善了蛋白质的功能特性,对开发新型食品和提高产品品质具有积极的促进作用,应用前景十分广阔。但是,转谷氨酰胺酶到目前为止并没有在中国的食品工业中得到广泛的推广应用,主要原因在于：1进口转谷氨酰胺酶价格昂贵,使用它将大大提高食品的生产成本：2国内使用的产转谷氨酰胺酶菌株产酶量较低,酶活也不高,生产成本较为昂贵。为了获得能够高产的基因工程菌,首先需要获得产转谷氨酰胺酶的野生菌。本实验利用简便的蛋白质交联凝絮-沉淀性能测定试验进行初筛,最终获得一株酶活达到0.47U/m1的野生菌株,经生理生化及16SrDNA鉴定后属于放线菌纲的链霉菌属（Streptomyces sp.）。然后扩增出转谷氨酰胺酶的基因,并在大肠杆菌中表达,以获得高产的重组转谷氨酰胺酶。主要研究结果如下：1.产转谷氨酰胺酶菌株的筛选。采集了多份土壤,为了避免在菌种初筛过程中就直接测定MTG活性而需要大量使用价格昂贵的酶作用底物CBZ-Gln-GLy,节省时间精力和经费开支,采用蛋白质交联凝絮-沉淀性能测定试验进行初筛,然后复筛时在测定酶活,筛选出活性相对较高的菌株St4,酶活达到0.47U/m1。2.菌株的鉴定。根据菌株形态、培养特征、生理生化特性、16S rDNA序列分析等进行多项分类鉴定研究,初步鉴定出St4为放线菌类链霉菌属中的吸水链霉菌。3.MTG基因的扩增。设计简并引物,首先扩增出含活性中心的中心序列,然后用sitefinding-PCR分别扩增出上下游序列,完成对MTG全长基因的扩增。吸水链霉菌st4的MTG基因编码区总长为1251bp,与已公布来源的吸水链霉菌推测的转谷氨酰胺酶基因序列EU477523比较,有214个碱基的差异,核苷酸序列的同源性为83%,第149位氨基酸Cys为活性中心位点,成熟酶分子中催化三联体为Cys149-His359-Asp346与其它链霉菌来源的同源酶一致。4.转谷氨酰胺酶表达及发酵条件优化。将MTG基因与大肠杆菌胞内表达载体pET-23（a）和pET-32（a）连接,构建重组质粒pET-23（a）-MTG和pET-32（a）-MTG,转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。使用SDS-PAGE电泳、酶活测定的检测证明MTG的正确表达,接着对重组酶的发酵条件进行优化,优化结果表明：该转谷氨酰胺酶重组菌在pH6.5的LB培养基中培养至2.5h时,加入IPTG至终浓度为75μg/mL,30℃诱导培养4h酶活达到10.23U/m1。优化后,较原始菌发酵条件的酶活提高了1.85倍,较野生菌提高了近22倍。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写符号
• 表格索引
• 图形索引
• 第一章 文献综述
• 1 转谷氨酰胺酶研究进展
• 1.1 转谷氨酰胺酶的来源
• 1.2 转谷氨酰胺酶的生产方法
• 1.2.1 动植物组织提取法
• 1.2.2 微生物发酵生产法
• 1.2.3 基因克隆方法
• 1.2.4 微生物转谷氨酰胺酶（MTG）的生产研究历史
• 1.3 微生物转谷氨酰胺酶（MTG）的主要理化性质
• 1.4 转谷氨酰胺酶的结构分析
• 1.5 转谷氨酰胺酶的催化机理及测定方法
• 1.6 转谷氨酰胺酶的在食品工业的应用
• 1.6.1 肉制品加工中的应用
• 1.6.2 在烘焙食品中的应用
• 1.6.3 乳制品加工中的应用
• 1.6.4 水产品加工中的应用
• 1.6.5 在食品包装及保藏中的应用
• 2 转谷氨酰胺酶的基因克隆和表达研究进展
• 3 大肠杆菌表达系统的概述
• 3.1 大肠杆菌表达系统的优点
• 3.2 大肠杆菌表达系统的缺点
• 3.3 各种类型大肠杆菌表达系统的构成及特点
• 3.3.1 Lac和Tac表达系统
• 3.3.2 PL和PR表达系统
• 3.3.3 T7表达系统
• 3.4 大肠杆菌表达系统研究进展
• 4 本研究的目的意义及内容
• 4.1 研究目的意义
• 4.2 研究内容
• 参考文献
• 第二章 产转谷氨酰胺酶菌株的筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 土壤
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 初筛
• 1.2.2 初筛的原理
• 1.2.3 复筛的原理
• 1.2.4 测定酶活试剂A液和B液的配制
• 1.2.5 测定酶活的标准曲线
• 1.2.6 测定酶活
• 2 结果与分析
• 2.1 初筛的结果
• 2.2 测酶活的标准曲线
• 2.3 复筛
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第三章 转谷氨酰胺酶产生菌St4的初步鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 培养基
• 1.1.5 溶液配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 形态特征
• 1.2.2 培养特征
• 1.2.3 生理生化实验
• 1.2.4 16SrDNA序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 形态学特征,培养特征和生理生化特性结果
• 2.1.1 形态特征
• 2.1.2 培养特征和生理生化特征
• 2.2 16SrDNA序列结果
• 2.2.1 液氮研磨法提取放线菌基因组DNA
• 2.2.2 16SrDNA基因的扩增结果
• 2.2.3 回收后的16SrDNA与克隆载体连接和连接产物的转化
• 2.2.4 提取重组质粒
• 2.2.5 16SrDNA测序结果
• 2.3 构建系统发育树
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第四章 Streptomyces hygroscopicus St4转谷氨酰胺酶基因的克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株与质粒
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 溶液配制
• 1.1.5 PCR引物
• 1.1.6 培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 吸水链霉菌总DNA提取
• 1.2.2 紫外光谱分析法测定DNA纯度
• 1.2.3 SiteFinding-PCR扩增目的基因MTG
• 1.2.4 PCR产物与载体pMD19-T的连接
• 1.2.5 大肠杆菌感受态制备
• 1.2.6 载体pMD19-T连接产物转化大肠杆菌感受态细胞
• 1.2.7 PCR产物的克隆、鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 吸水链霉菌总DNA提取
• 2.2 转谷氨酰胺酶基因的扩增、PCR产物的克隆、鉴定及序列测定
• 2.2.1 MTG基因内部片段的扩增、PCR产物的克隆、鉴定及序列测定
• 2.2.2 Site-finding PCR方法扩增转谷氨酰胺酶基因上下游序列
• 2.2.3 MTG基因全长的扩增、PCR产物的克隆、鉴定及序列测定
• 2.3 吸水链霉菌转谷氨酰胺酶基因序列分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第五章 转谷氨酰胺酶基因mtg在大肠杆菌中的表达及发酵条件优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要仪器和试剂
• 1.1.2 质粒与菌株
• 1.1.3 PCR引物
• 1.1.4 培养基
• 1.1.5 试剂的配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 重组工程菌的构建
• 1.2.2 目的基因在大肠杆菌中的诱导表达
• 1.2.3 BL21/pET-23（a）-mtg表达条件的优化
• 1.2.4 表达产物Ni-NTA亲和层析纯化
• 2 结果与分析
• 2.1 BL21/pET-23（a）-mtg（pET-32（a）-mtg）重组质粒的构建
• 2.1.1 目的基因PCR扩增
• 2.1.2 pET-23（a）,pET-32（a）载体和目的基因的制备
• 2.1.3 pET-23（a）,pET-32（a）载体和目的基因的连接及鉴定
• 2.2 mtg在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.2.1 重组质粒稳定性检测
• 2.2.2 重组菌体表达产物的SDS-PAGE分析及酶活测定
• 2.2.3 BL21/pET-23（a）-mtg表达条件的优化
• 2.2.4 表达产物Ni-NTA亲和层析纯化及融合蛋白配体的酶切
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 全文结论
• 论文创新点
• 致谢