序贯共培养体系对小鼠体外受精胚胎发育效果的影响

论文摘要

动物体外受精（In vitro fertilization,简称IVF）研究已有百余年的历史。IVF技术对于揭示配子发育、成熟、受精和早期胚胎细胞分化等生命现象的奥秘具有重要意义。在体外受精的操作过程中,卵母细胞可以自发成熟,但是受精、卵裂及早期胚胎体外发育的成功率都很低,而且体外受精胚胎体外发育也存在发育阻滞问题。为了更好的模拟卵母细胞和早期胚胎在体内发育的微环境,促进体外受精的成功,国内外研究者在近几年做了大量试验。哺乳动物早期胚胎的发育始于输卵管,然后进入子宫,最终在子宫发育为胎儿。以前的胚胎体外共培养研究仅限于某种细胞与胚胎一直共培养到囊胚,这种体系虽然提高了胚胎体外发育率及发育质量,但仍然不能很好的模拟体内发育环境。本研究目的在于更好的模拟卵母细胞和早期胚胎在体内发育的微环境,为胚胎体外培养提供一个更为适宜的试验方法。试验采用0.25%胰酶消化的方法,分别分离获得输卵管上皮细胞和子宫内膜细胞,同时对培养的两种细胞在体外的生长增殖规律进行初步探索,用台盼蓝排斥试验检测活细胞数。经冷冻解冻细胞为序贯共培养体系体外构建提供大量的种子细胞;将精子分别置于HTF液和T6液中,观察两种获能受精液对小鼠卵母细胞体外受精的影响;将体外受精得到的早期胚胎分别与KSOM-AA液、输卵管上皮细胞、子宫内膜细胞及序贯共培养体系共培养,观察其对小鼠体外受精胚胎发育效果的影响。试验结果表明:（1）采用0.25%胰酶消化的方法分离获得上皮细胞,检测活细胞率达90%以上,细胞经冷冻解冻的活细胞数达到85%以上;（2）采用0.25%胰酶消化的方法获得的子宫内膜细胞,活细胞数达90%以上,细胞经冷冻解冻的活细胞数达到75%以上;（3）小鼠成熟的卵母细胞适宜选用HTF液进行体外受精;（4）序贯共培养体系胚胎的囊胚体外发育率显著高于其他共培养组（P<0.05）。实验结果表明序贯共培养体系比单一体细胞共培养体系能更好地模拟体内环境,提高体外受精胚胎的发育率;（5）初步建立了小鼠体外受精胚胎体外培养的序贯共培养体系,为下一步研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一篇 文献综述
• 第一章 序贯共培养体系构建所需细胞体外培养研究进展
• 1.1 输卵管上皮细胞的体外培养研究进展
• 1.1.1 输卵管上皮细胞的建立及传代
• 1.1.2 输卵管上皮细胞共培养的应用价值
• 1.2 子宫内膜细胞的体外培养研究进展
• 1.2.1 进行子宫生理研究
• 1.2.2 用于建立体外病理研究模型
• 1.2.3 作为饲养层建立体外三维培养体系
• 1.2.4 作为早期胚胎体外发育的研究模型
• 1.2.5 作为医疗移植替代物进行病损组织的替代治疗
• 第二章 早期胚胎体外培养体系研究进展
• 2.1 单独培养液培养体系
• 2.2 胚胎与单层辅助细胞共培养体系
• 2.2.1 共培养研究的目的
• 2.2.2 用于共培养的细胞及其对胚胎发育的影响
• 2.2.3 共培养的应用方式
• 2.2.4 共培养作用的可能机制或影响因素
• 2.2.5 共培养的前景
• 2.3 三维共培养体系的建立
• 2.4 序贯共培养体系的建立
• 第三章 小鼠体外受精研究进展
• 3.1 卵母细胞体外成熟
• 3.1.1 卵母细胞的获取
• 3.1.2 卵母细胞体外成熟的培养体系
• 3.1.3 卵母细胞体外成熟的影响因素
• 3.1.4 腔前卵泡卵母细胞体外成熟培养体系
• 3.1.5 卵母细胞体外成熟的判定
• 3.2 精子获能
• 3.2.1 几种常用的精子体外获能体系
• 3.2.2 精子获能的判定
• 3.3 体外受精
• 3.3.1 体外受精的影响因素
• 3.3.2 显微受精（Micro fertilization）
• 3.4 受精卵的体外培养
• 3.4.1 胚胎体外发育阻滞
• 3.4.2 受精卵体外培养系统
• 3.5 本研究的目的和意义
• 第二篇 试验研究
• 第四章 输卵管上皮细胞体外分离培养的试验研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要试剂
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 实验动物
• 4.2.4 取样
• 4.2.5 观测指标
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 兔输卵管上皮细胞的分离
• 4.3.2 兔输卵管上皮细胞的培养观察
• 4.3.3 兔输卵管上皮细胞生长曲线
• 4.3.4 台盼蓝排斥实验检测活细胞比例
• 4.3.5 兔输卵管上皮细胞的冷冻及解冻效果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 子宫内膜细胞体外分离培养的试验研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 试验所需试剂
• 5.2.2 主要仪器
• 5.2.3 实验动物
• 5.2.4 取样
• 5.2.5 观测指标
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 兔子宫内膜细胞的分离
• 5.3.2 兔子宫内膜细胞的培养观察
• 5.3.3 兔子宫内膜细胞生长曲线
• 5.3.4 台盼蓝排斥实验检测活细胞比例
• 5.3.5 兔子宫内膜细胞的冷冻及解冻效果
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 第六章 序贯共培养体系对小鼠体外受精胚胎体外发育的影响
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 试剂及仪器
• 6.2.2 实验动物
• 6.2.3 输卵管及子宫的采集
• 6.2.4 输卵管上皮细胞的分离和培养
• 6.2.5 子宫内膜细胞分离培养
• 6.2.6 小鼠卵母细胞体外成熟及体外受精
• 6.2.7 试验设计
• 6.2.8 观测指标及数据处理
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 家兔输卵管上皮细胞的体外培养及传代
• 6.3.2 家兔子宫内膜细胞体外培养及传代
• 6.3.3 两种获能受精液与小鼠卵母细胞体外受精后获得的受精率
• 6.3.4 不同培养体系对小鼠体外受精胚胎发育效果的影响
• 6.4 讨论与小结
• 结论
• 创新点
• 需进一步研究的问题
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介