REM睡眠剥夺对大鼠脑内质网应激相关蛋白ATF4表达的影响

论文摘要

[研究背景及目的]现代社会中人们睡眠时间呈逐渐减少趋势,睡眠剥夺已成为睡眠障碍的一种表现形式。REM睡眠与认知心理活动及脑的生长发育有关,在记忆巩固、蛋白合成、基因表达等方面发挥关键作用。睡眠剥夺作为一种应激源,类似于饥饿、缺氧等,可造成机体正常生理功能紊乱。临床研究表明睡眠剥夺可引起机体免疫功能下降、学习记忆能力下降及情绪障碍等一系列改变。对于睡眠剥夺与内质网应激的关系目前国内外研究很少,国外有文献报道鼠睡眠剥夺后GRP78/BIP含量以及eIF2α磷酸化水平发生明显变化,同时我们科室以往的研究已经发现REM睡眠剥夺可使内质网应激标志性蛋白GRP94等表达增高。本试验选择REM睡眠剥夺,旨在探讨REM睡眠剥夺后脑损害的病理生理机制。内质网广泛存在于真核细胞中,是细胞加工蛋白质和贮存钙离子的主要场所。细胞营养物质缺乏、影响内质网（ER）钙离子平衡的药物、氧化应激、病毒感染等多种因素可导致内质网功能失衡,形成内质网应激（ERS）。内质网应激后细胞发生一系列反应以减少细胞功能损害,保护细胞正常的功能。具体有以下3个方面:1.伴侣分子及与蛋白折叠相关酶的增多与未折叠蛋白结合以减少损害及使未折叠蛋白重新正确折叠。2.蛋白合成的短暂抑制以减少内质网负荷。3.与蛋白降解有关的酶增多加速未折叠蛋白降解以进一步减轻内质网负荷。其中由蛋白质堆积所引起的一系列后续反应称为未折叠蛋白反应（UPR）。内质网应激是一种重要而基本的细胞保护手段,但在应激因素过强时可诱导细胞凋亡,从而对机体组织或器官造成损伤。近年来国内外研究发现内质网应激与中枢神经系统的许多疾病的发生发展密切相关,包括阿尔茨海默病、帕金森病、脑梗死、Huntnington病。本课题的研究目的在于明确睡眠剥夺与内质网应激的相关性,对探讨睡眠剥夺的危害机制及相应的干预措施具有重要的理论意义。目前已知的UPR的细胞内信号传导途径包括Irel依赖的途径和以PERK和ATF6为主要信号传导因子的3条不同途径。本课题选择其中一条途径即PERK介导的eIF2α磷酸化途径中的转录激活因子ATF4为研究对象。该途径主要包括以下几个部分:1.内质网应激早期蛋白质合成暂停内质网应激时与PERK结合的BiP由于应付大量的未折叠蛋白质而使得内质网内PERK蛋白暴露,发生自身磷酸化与二聚化,活化的PERK蛋白进一步使内质网外侧的elF2a发生磷酸化修饰,磷酸化修饰的elF2a不受eIF2β的GTP-GDP的交换作用,使得多数蛋白质合成启动过程暂停。2.内质网应激中期整合应激反应的出现短期内蛋白质合成的暂停减轻了新生蛋白肽链对内质网蛋白折叠需求的负荷与压力,但长期的蛋白质合成抑制则导致细胞凋亡。elF2a磷酸化抑制了大多数蛋白质合成,但同时通过影响ATF4与核糖体的结合效率促进了ATF4的翻译,ATF4蛋白含量的增加促进一系列伴侣分子转录的活化,如GADD34、GADD153等,其中GADD34使elF2a去磷酸化以恢复蛋白质合成,维持细胞正常功能,如应激过强或时间过长超出细胞自我调整范围则通过GADD153诱发细胞凋亡。ATF4（Activating Transcription Factor 4）:也叫CREB2（CAMP-response Element protein 2）,是ATF-CREB bZIP家族中一员。ATF4mRNA存在于各种细胞中,其中在颅骨、脑、胸腺、肝等器官中含量较高,但ATF4蛋白在细胞中含量很低或无法测到,考虑为ATF4mRNA5’端的上游开放阅读框（uORFS）抑制其翻译有关。在内质网应激时,PERK介导的eIF2α磷酸化使ATF4mRNA与核糖体结合效率增高,促进ATF4的翻译。ATF4蛋白含量的增高可引起一系列伴侣分子的表达如:GADD34、GADD153等,在内质网应激中发挥重要作用。本课题观察REM睡眠剥夺后在PERK-eIF2α通路中ATF4蛋白表达情况,从而证实REM睡眠剥夺可诱发内质网应激,ATF4蛋白表达的增多可以促进GADD34、GADD153等一系列伴侣分子转录的活化,从而在恢复蛋白质合成、维持细胞正常功能及控制细胞凋亡等方面发挥重要作用。[试验方法]大鼠随机分为睡眠剥夺组（SD组n=40）、环境对照组（TC组n =10）和正常睡眠对照组（CC组n =10）,其中SD组又分为睡眠剥夺6小时、12小时、1天、3天四组,每组10只大鼠。采用改良多平台睡眠剥夺法（MMPM）进行不同时间REM睡眠剥夺,应用免疫组织化学方法检测额叶及海马ATF4分布及含量,应用Western blot技术检测额叶及海马标本中ATF4蛋白变化情况。[实验结果]1.免疫组织化学方法在正常睡眠组（CC组）海马及额叶均未检测出ATF4蛋白。海马自环境对照组（TC组）开始出现ATF4蛋白表达,SD6小时组表达大于TC组（P<0.01）,SD 12小时达到高峰（与各实验组相比P<0.01）,SD 1天、3天呈逐渐下降趋势,SD 3天时与TC组相比无差异（P>0.05）。额叶自TC组开始出现ATF4蛋白表达,SD 6小时表达大于TC组（P<0.05）,SD 12小时达到高峰（与各实验组相比P<0.01）,此后SD 1天、3天呈逐渐下降趋势,SD 3天时表达仍大于TC组（P<0.05）。SD 6小时组与SD 3天组对比无差异（P>0.05）。2.Western blot方法显示正常睡眠组（CC组）海马及额叶均未检测出ATF4蛋白。海马自TC组ATF4开始表达,SD 6小时表达大于TC组（P<0.05）, SD 12小时表达到高峰（与各实验组相比P<0.01）,此后SD 1天、3天呈逐渐下降趋势,各组表达均大于TC组（P<0.05）,SD6小时组与SD3天组相比无明显差异（P>0.05）。额叶自TC组开始出现ATF4表达,SD12小时表达达到高峰（与各实验组相比P<0.01）,此后表达减少,各组表达均大于TC组（P<0.01）,SD6小时组与SD3天组表达无差异（P>0.05）。[结论]1.在正常大鼠脑组织中ATF4主要以mRNA形式存在。2.REM睡眠剥夺可剥夺诱发内质网应激。3.REM睡眠剥夺后大鼠海马与额叶发生内质网应激的时间及发展趋势基本相同。

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• REM 睡眠剥夺对大鼠脑内质网应激相关蛋白ATF4 表达的影响
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