论文摘要
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）引起的,以母猪繁殖障碍,仔猪、育肥猪呼吸道疾病为临床症状的病毒性传染病。该病在1987年首次报道于美国,随后呈全球性流行,给世界养猪业造成重大经济损失。PRRSV属于套氏病毒目（Nidovirales）、动脉炎病毒科（Arteriviridae）、动脉炎病毒属（Arterivirus）成员,单股正链RNA病毒,基因组全长约15.4 kb,包括9个开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）,其中ORF1a、ORF1b编码病毒的非结构蛋白,ORF2-7编码病毒的结构蛋白。ORF1a和ORF1b占基因组全长的3/4,编码的多聚蛋白pp1a和pp1ab最终可水解为14个非结构蛋白（Nonstructural Protein,Nsp）。这些非结构蛋白在PRRSV的复制过程中起重要作用。目前Nsp7的结构及其在PRRSV病毒生命周期中的作用仍然未知。按照欧洲型PRRSV Lelystad株各非结构蛋白划分,Nsp7的起止位置为Ser 2083 Glu 2351。北美洲型PRRSV VR-2332株Nsp7的起止位置为Ser 2200 Glu 2458氨基酸。我国流行的PRRSV主要是北美洲型,由于HuN4株较VR-2332株在Nsp2处存在30个氨基酸的缺失,所以HuN4株Nsp7的起止位置为Ser 2170Glu 2428。Nsp7共259个氨基酸,由777个碱基编码。研究显示Nsp7可诱导机体产生高水平的抗体,并能维持较长时间,说明Nsp7与机体免疫应答关系密切。由于Nsp7基因在非结构蛋白中相对保守,不同毒株之间差异变化较小,因此Nsp7适用用于作为检测抗原检测不同毒株刺激机体产生的抗体。因此研究Nsp7在病毒的复制和转录中的作用、功能及对PRRSV致病力的影响将尤为重要。为进一步揭示PRRSV Nsp7的免疫原性,本研究根据PRRSV HuN4株全基因序列,设计合成用于扩增PRRSV HuN4株Nsp7基因的引物。将扩增产物连接到原核表达载体pET30a（+）中,成功构建重组质粒pET-Nsp7,将其转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,IPTG诱导表达。Western blot试验证明,Nsp7在大肠杆菌中获得大量的表达,并且其具有较好的反应活性。经镍离子亲和层析获得了高纯度的可溶性重组蛋白。用纯化的Nsp7作为包被抗原,通过优化抗原包被浓度、血清样品稀释度、一抗作用时间、二抗作用时间、二抗工作浓度及显色液作用时间,建立可以从血清中检测PRRSV抗体的重组Nsp7间接ELISA检测方法。通过检测已知背景的70份阳性血清和50份阴性血清,应用ROC软件分析检测结果,确定该检测方法的临界值（cut off value）为0.09时,灵敏度（Sensitivity）为99.2%,特异度（Specificity）为100%。将临床送检的260份血清用所建立的Nsp7-ELISA与国外进口的PRRS抗体检测试剂盒进行平行检测,显示Nsp7-ELISA与IDEXX PRRS X3抗体检测试剂盒的相关性较好。用纯化的Nsp7免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合,经过间接ELISA筛选,有限稀释法克隆,IFA验证,获得3株稳定分泌Nsp7抗体的杂交瘤细胞,分别命名25D2、31A8和43B2。3株杂交瘤细胞上清效价分别为1︰512、1︰1024和1︰512,小鼠腹水效价分别为1︰2.56×104,1︰1.024×105和1︰2.56×104。
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标签：猪繁殖与呼吸综合征病毒论文; 原核表达论文; 单克隆抗体论文;