论文摘要
目的在全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)的作用下,研究小鼠胚胎大脑皮层神经元细胞p38MAPK、SRC-3的磷酸化改变以及SRC-3的降解与RARα的转录激活活性之间的关系。方法取16天正常孕鼠胚胎进行大脑皮层神经元细胞的剥离并利用NEOCORTICAL CELL DISSECTION的培养方法进行神经元细胞的原代培养。待细胞生长密度至80%左右时:1.用ATRA干预细胞不同时间后,利用Western-immunoblotting检测p38MAPK和SRC-3的磷酸化水平以及SRC-3和RARα的蛋白总量;利用凝胶滞留电泳(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)技术检测RARα的转录激活活性;采用半定量RT-PCR技术检测HOXd3基因表达情况;2.选取关键时间点16h,同时给予ATRA和泛素-蛋白酶体抑制剂MG 132干预细胞,利用Western- immunoblotting检测SRC-3的蛋白总量;3.选取关键时间点16h,同时给予ATRA和p38MAPK抑制剂SB203580干预细胞,利用Western-immunoblotting检测SRC-3的磷酸化水平以及SRC-3和RARα的蛋白总量;利用EMSA检测RARα的转录激活活性;采用半定量RT-PCR技术检测HOXd3基因表达情况;4.选取关键时间点16h,同时给予ATRA和ERK (p42/44) MAPK抑制剂PD98059干预细胞,利用Western-immunoblotting检测SRC-3的磷酸化水平以及SRC-3的蛋白总量。结果1. p38MAPK的激活引起了ATRA诱导的SRC-3的磷酸化用ATRA干预神经元细胞时,我们通过Western-immunoblotting发现p38MAPK的磷酸化在干预2h时即被检测到,并且在整个48h的干预过程中呈增加趋势。同时,我们观察到ATRA诱导的SRC-3的磷酸化呈时间依赖性的增加。当用ATRA和p38MAPK的特异性抑制剂SB203580同时干预神经元细胞时,SRC-3的磷酸化现象被抑制。当用ATRA和ERK (p42/44) MAPK的特异性抑制剂PD98059同时干预神经元细胞时,SRC-3的磷酸化现象不能被抑制。2.抑制p38MAPK的激活作用后阻止了ATRA诱导的SRC-3的降解当用ATRA干预神经元细胞不同时间后,我们通过Western-immunoblotting分析SRC-3总蛋白水平。结果显示,SRC-3总蛋白在干预8h内没有变化,但是在干预16h时SRC-3总蛋白开始降低,干预48h时SRC-3总蛋白几乎完全消失。像SRC-3的磷酸化一样,ATRA诱导的SRC-3总蛋白的降低现象被p38MAPK的特异性抑制剂SB203580所抑制,但不能被ERK (p42/44) MAPK的抑制剂PD98059所抑制。此外,ATRA诱导的SRC-3总蛋白的降低现象被特异的蛋白酶体抑制剂MG132所抑制。3.抑制p38MAPK的激活作用后增强了RARα和RARE之间的相互作用我们通过EMSA分析了p38MAPK激活的SRC-3的磷酸化与RARα转录激活活性之间的关联性。我们提取细胞核蛋白通过EMSA检测RARα和DR5 RARE之间的特异性结合。结果显示,DR5 RARE冷探针和抗RARα抗体全都阻止了RARα和DR5 RARE复合物的形成,表明RARα特异地与DR5 RARE相互作用并且形成一个复合物。我们还发现,神经元细胞RARα和DR5 RARE之间的结合能力在ATRA的干预下显著增强,在干预2h时开始增强,16h达到顶峰。当用ATRA和p38MAPK的特异性抑制剂SB203580同时干预神经元细胞16h时,我们观察到,ATRA诱导的RARα和DR5 RARE之间的结合能力发生显著的增强。以上实验表明,RARα和DR5 RARE之间的相互作用随着ATRA作用时间的延长而逐级增强。我们研究ATRA的干预作用是否可以增强RARα总蛋白的表达,结果显示,ATRA的干预作用降低了细胞RARα蛋白总量。RARα蛋白总量的降低现象在ATRA干预2h时即开始发生,到干预8h时保持同样的水平,当干预16h和48h时进一步发生了轻微下降。RARα蛋白总量的降低现象不能被p38MAPK的特异性抑制剂SB203580所抑制。4.抑制p38MAPK的激活作用后增强了分化基因HOXd3的表达我们选用HOXd3基因作为ATRA作用的靶基因,通过RT-PCR研究p38MAPK是否与ATRA诱导的靶基因表达有关。结果显示,在ATRA的干预下,HOXd3基因表达的变化与RARα和DR5 RARE之间的结合能力的变化相同,在ATRA作用的神经元细胞,HOXd3基因的表达在干预2h时开始增强,16h时达到顶峰。同样,p38MAPK的特异性抑制剂SB203580增强了HOXd3基因的表达。结论1.ATRA引起了神经元细胞p38MAPK和SRC-3的磷酸化,而且,SRC-3的磷酸化依赖于p38MAPK途径;2.ATRA作用于神经元细胞后,SRC-3磷酸化后成为泛素-蛋白酶体的作用靶标,被泛素-蛋白酶体识别并降解; SRC-3的降解依赖于p38MAPK途径;3.在ATRA作用神经元细胞起始阶段,p38MAPK通过磷酸化SRC-3,使SRC-3与RARα之间相互作用增强,从而增强了RARα的转录激活活性。但是,p38MAPK的抑制剂在该事件后期却可以促进RARα的转录激活活性,可能是由于抑制了SRC-3的降解或者涉及其他机制从而促进RARα的转录激活活性;4.ATRA通过p38MAPK途径,调节RARα的转录激活活性,并且诱导下游分化基因HOXd3的表达。
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