论文摘要
经皮冠状动脉腔内成形术（PTCA）和支架植入术是目前治疗冠心病的重要手段,但术后的支架再狭窄严重影响了其远期疗效。虽然以往人们探讨了许多方法希望能解决再狭窄问题,包括高压球囊扩张、再次植入支架、球囊旋切术、激光成形术等,但仍有10%-30%的患者会在支架内及支架边缘出现再狭窄。寻找合适的药物预防和治疗支架再狭窄对于减少冠心病患者心血管事件的发生、提高生活质量、延长寿命及减轻国家和个人经济负担具有重大意义。内膜增殖是支架再狭窄的主要病理改变,局部炎症反应是主要原因,应用抗炎治疗有可能减轻内膜增生。瑞舒伐他汀钙（Rosuvastatin）是新型的他汀类药物,现在已经证明具有明显的降低低密度脂蛋白胆固醇作用。一些实验和临床研究显示瑞舒伐他汀钙具有改善内皮功能、降低氧化型低密度脂蛋白、减轻炎症、稳定斑块等独立于降脂之外的减轻动脉硬化进展的作用,本研究先通过制作家兔球囊损伤动物模型,观察瑞舒伐他汀钙在对损伤血管的反应,探讨瑞舒伐他汀钙在损伤内膜的血管中的作用,再通过培养血管平滑肌细胞（VSMC）,从细胞水平观察瑞舒伐他汀钙对VSMC中TGF-β1基因表达的影响,探讨其在防治支架再狭窄中的地位,为治疗支架再狭窄提供理论依据。第一部分:目的:比较不同大小球囊导管制作血管内膜损伤动物模型的效果,寻找合适的球囊导管和制作方法制作血管内膜损伤的动物模型。方法:我们采用健康雄性新西兰兔30只,适应喂养2周后随机分成三组各10只:其中10只做为假手术组进行对照,其余20只分为2.5mm球囊组和3.5mm球囊组制做球囊损伤模型。分别采用不同大小2.5mm*15mm和3.5mm*15mm的球囊导管经股动脉制作腹主动脉球囊损伤的动物模型,三组均予阿斯匹林25mg 1/日,氯比格雷25mg 1/日灌胃,分组喂养4周后用气体栓塞法处死兔,截取球囊损伤处血管组织2cm节段,制成厚5μm切片,行HE染色,在光学显微镜下测量动脉内膜及中膜厚度,分别计算横截面管腔内径、新生内膜层和中部平滑肌细胞层的平均厚度,计算3个视野的平均值,最后计算内膜/中膜比值。结果:1、手术后一般情况比较:所有家兔均顺利完成手术,手术时间10～40min,假手术组手术时间为15.5±3.28min明显短于2.5mm球囊组手术时间28.6±4.09min和3.5mm球囊组的34.9±6.06min,三组手术时间两两相比均有统计学差异,（P<0.05）。三组中26只术后第2日开始进食水,3只术后第3日开始进食水,1周后均恢复正常饮食及运动。4周喂养时间内只有1只家兔第3周死于腹泻,其余29只家兔均存活至实验结束,存活者无并发症出现,造模成功率95%,两组术后进食、恢复运动活力情况均无明显差异。2、光镜下观察内膜增生情况:HE染色显示,光镜下可见球囊损伤的两组管壁均不光滑,内膜增厚,管腔狭窄,部分内弹力板断裂,内弹力层附近的血管平滑肌细胞纵向排列,呈向内膜方向生长的趋势,动脉平均狭窄程度同假手术组相比分别为22.1±3.5%和32.5±5.8%,三组相比均有统计学差异,3.5mm球囊组狭窄重于2.5mm球囊组,2.5mm球囊组重于假手术组。内膜厚度3.5mm球囊组为0.07±0.03 mm大于2.5mm球囊组0.03±0.02mm和假手术组0.02±0.03mm,有统计学差异（P<0.05）。3.5mm球囊组中膜厚度为0.16±0.03mm大于假手术组的0.12±0.02mm,有统计学差异（P<0.05）,而与2.5mm球囊组0.14±0.02mm相比无统计学差异（P>0.05）。内膜/中膜3.5mm球囊组为0.44±0.11大于2.5mm球囊组0.21±0.05大于假手术组0.17±0.06,三组两两比较均有统计学差异（P<0.05）。结论:采用直径为3.5mm的球囊导管制作血管内膜损伤动物模型优于直径为2.5mm的球囊导管,直径为3.5mm的球囊导管是制作腹主动脉球囊损伤较理想的球囊导管。第二部分:目的:观察瑞舒伐他汀钙对家兔血管内膜损伤的影响。方法:我们采用健康雄性新西兰兔20只,采用3.5mm*15mm的球囊经股动脉制作腹主动脉球囊损伤的动物模型,造模成功后随机分成对照组和他汀组各10只,两组均予阿斯匹林25mg 1/日,氯比格雷25mg 1/日灌胃,他汀组加用瑞舒伐他汀钙1mg/（kg·d）,分组喂养6周后从耳缘静脉采集静脉血5ml,采用酶法测定血生化指标:总胆固醇（TC）,甘油三酯（TG）,高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）,肝肾功能、血糖、同型半胱氨酸等。同时采用经颈动脉行腹主动脉造影后,采用同一标准对影像进行分析,应用数字减影血管造影仪（德国西门子,COROSKO-PHS）作血管狭窄定量分析。随后空气栓塞法处死家兔,截取球囊损伤处血管组织2cm节段,常规石蜡包埋,制成厚5μm切片,行HE染色,在光学显微镜下测量动脉内膜及中膜厚度,分别计算横截面管腔内径、新生内膜层和中部平滑肌细胞层的平均厚度,计算内膜/中膜比值。结果:1、两组家兔血生化结果:两组家兔相比肝功能、肾功能、同型半胱胺酸没有显著差异,在血脂方面瑞舒伐他汀组TC 0.8±0.45mmol/L,TG 0.9±0.22mmol/L及LDLC 0.4±0.05mmol/L明显低于对照组中TC 1.2±0.45mmol/L,TG 1.3±0.32mmol/L及LDLC 0.6±0.11mmol/ L（P<0.05）,有统计学意义。2、家兔腹主动脉造影结果:术后第6周行腹主动脉造影见血管远段髂动脉分叉前5 cm左右血管内膜不光滑,血管腔明显狭窄30%-50%,他汀组血管狭窄段最小内径（1.74±0.25mm ）明显较对照组（1.32±0.33mm）大,狭窄程度他汀组31.41%±7.08%明显较对照组55.25%±10.23%轻,两组有统计学差异（P <0.05）,而参照血管内径、管腔狭窄长度无统计学差异（P >0.05）。3、HE染色结果:光镜下可见两组管壁均不光滑,内膜增厚,管腔狭窄,内弹力层附近的血管平滑肌细胞纵向排列,呈向内膜方向生长的趋势,经过图像分析系统处理:他汀组内膜厚度、内膜/中膜（0.04±0.02mm,0.29±0.10）较对照组（0.08±0.03mm,0.50±0.11）减少了55%和42%,有统计学差异（P<0.05）,而横截面管腔横径（3.3±0.32mm vs 3.1±0.26mm）,他汀组较对照组增加了7%,和中膜厚度（0.14±0.02 vs 0.16±0.01）两组相比无显著差异（P>0.05）。结论:瑞舒伐他汀钙具有明显的降低LDLC、TC、TG作用。腹主动脉造影和HE染色提示它还具有抑制球囊损伤血管内膜增生的作用。第三部分:目的:观察瑞舒伐他汀钙对内膜损伤家兔血管壁中TGF-β1表达的影响。方法:采用前述经股动脉损伤后制作腹主动脉球囊损伤的动物模型制成的石蜡切片,采用免疫组化检测组织中TGF-β1蛋白表达情况;部分截取的腹主动脉壁,采用Trizol抽提总RNA,测定RNA纯度、浓度后进行RT-PCR检测基因表达情况。UVP型凝胶密度扫描仪对TGF-β1、β-actin扩增产物的电泳带进行密度扫描,计算相对比值。结果:1、免疫组化发现两组动物内膜及中膜内有染色为棕褐色的TGF-β1蛋白表达,瑞舒伐他汀组平均吸光度为0.413±0.13,TGF-β1阳性面积率为22.37±4.42%均明显低于对照组的0.568±0.17和40.58±7.45% （P<0.05）,两组相比有明显差异,有统计学意义。2、RT-PCR检测:RT-PCR检测显示两组动物内膜中均有有247bp的TGF-β1扩增产物。瑞舒伐他汀处理组表达值为25.32±5.13较对照组42.47±5.41明显减弱,两组相比有差异显著,有统计学意义,（P<0.05）。结论:瑞舒伐他汀钙具有抑制球囊损伤家兔血管壁中TGF-β1蛋白表达和基因表达的作用。第四部分:目的:观察瑞舒伐他汀钙对血管平滑肌细胞中TGF-β1和SMAD3表达的影响。方法:原代培养脐静脉平滑肌细胞,传代至3-6代时分别予10-7至10-3mmol/L浓度的瑞舒伐他汀钙刺激12h、24h后收集细胞,WESTERN-BLOT检测TGF-β1和SMAD蛋白表达情况,RT-PCR检测TGF-β1基因表达情况。结果:1、免疫印迹结果显示瑞舒伐他汀钙在10-7-10-3mol/L的浓度刺激均抑制TGF-β1蛋白表达。在刺激12h后,瑞舒伐他汀钙浓度为10-7-10-5mol/L的各组之间随浓度增加TGF-β1蛋白表达量逐渐减少,有统计学意义（P<0.05）,继续增加瑞舒伐他汀钙的浓度TGF-β1蛋白表达量不再减少,反而有增加趋势,10-4mol/L和10-3mol/L两组较10-5mol/L组表达量有所增加,差别有统计学意义;刺激24h后瑞舒伐他汀钙的浓度为10-7-10-3mol/L的各组TGF-β1蛋白表达量均较对照组明显降低,差别显著（P<0.05）,有统计学意义,在10-7-10-3mol/L的各组之间无显著差异,（P>0.05）。2、瑞舒伐他汀钙对VSMC中TGF-β1基因表达的影响:在刺激3h后,瑞舒伐他汀钙浓度为10-5-10-3mol/L的三个组TGF-β1 mRNA的表达量明显低于对照组,差别有统计学意义（P<0.05）,10-4mol/L和10-4mol/L组TGF-β1 mRNA的表达量低于10-5mol/L组,差别有统计学意义（P<0.05）,10-7 mol/L和10-6mol/L组同对照组相比无明显差异（P>0.05）;刺激6h后瑞舒伐他汀钙浓度为10-7-10-3mol/L的五个组TGF-β1 mRNA的表达量均低于对照组,有显著性差异（P<0.05）,TGF-β1 mRNA表达量随瑞舒伐他汀钙浓度的增加而减少,瑞舒伐他汀钙浓度在10-7mol/L至10-6mol/L之间TGF-β1 mRNA的表达量无明显差异（P>0.05）,但这两组均高于10-5mol/L组,差别有统计学意义（P<0.05）,10-3mol/L组TGF-β1 mRNA的表达量低于10-5mol/L组,差异有统计学意义（P<0.05）,10-4mol/L组和10-5mol/L组两组之间无统计学差异,（P>0.05）。3、SMAD3免疫印迹结果显示,瑞舒伐他汀钙刺激12小时之后,10-5-10-3mol/L的三组SMAD3蛋白表达量分别为对照组的84.65±14.5%、70.65±8.71%、78.25±5.21%,有统计学意义（P<0.05）。而10-7和10-6mol/L两组分别为91.87±4.25%和92.75±8.24%,同对照组相比无显著差异,（P>0.05）。同10-5mol/L组相比,只有10-4mol/L组表达量较低,有统计学意义（P<0.05）。刺激24小时后,10-7-10-3mol/L的五组SMAD3蛋白表达量分别为对照组的85.55±8.47%、75.69±7.24%、68.35±7.65%、57.57±9.32%和80.54±6.35%,各组均低于对照组,有统计学意义（P<0.05）。同10-5mol/L组相比,10-7mol/L和10-3mol/L两组组表达量明显增高,而10-4组明显减低,有统计学意义（P<0.05）。结论:瑞舒伐他汀钙抑制血管平滑肌细胞中TGF-β1/ SMAD3蛋白和基因表达。
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