大肠杆菌耐药基因acrA、acrR的克隆与表达菌株的初步筛选

论文摘要

目前由于抗生素在大肠杆菌病防治过程中的长期、广泛、不合理应用,大肠杆菌耐药特别是多重耐药现象已十分严重,由耐药菌株引起的人及动物感染性疾病不断增加。大肠杆菌的多重耐药主要与其主动外排系统的超量表达有关,主动外排系统的超量表达可引起细菌对多种抗生素高频率、高水平耐药。AcrAB-TolC外排泵是大肠杆菌最主要的主动外排系统,若使该系统失活,大肠杆菌可从多重耐药状态变为相对敏感状态。AcrAB-TolC包括药物质子转运子AcrB、问质融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC,其表达水平受多种调控因子的调节,如AcrR、MarA、MppA、SdiA、Rob和SoxS等。其中AcrR为一负向调控子,主要调控AcrAB-TolC外排泵在最低水平表达。本实验首先选取大肠杆菌药敏质控株ATCC25922及5株临床分离的不同动物源性大肠杆菌,分别以其染色体DNA为模板,通过PCR反应扩增出大肠杆菌多重耐药基因acrA和大肠杆菌多重耐药调控基因acrR基因片段,将扩增片段分别与克隆载体pMD18-Tsimple Vector连接,连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中,对经KpnI、XbaI酶切与PCR反应鉴定为阳性的克隆质粒进行插入片段的核苷酸序列测定。测序结果表明:不同源性大肠杆菌的acrA基因与acrR基因核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与GeneBank中该基因序列的同源性较高,acrA基因核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与GeneBank中该基因序列的同源性分别为99.1～100%,99.7～100%;acrR基因核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与GeneBank中该基因序列的同源性分别为98.2～100%,98.6～100%。在对acrA基因和acrR基因的克隆以及序列同源性比较分析的基础上,将重组质粒pMD18-T-acrA、pMD18-T-acrR与表达载体质粒pPICZαA分别用KpnI、XbaI酶切后构建成表达重组质粒pPICZaA-acrA、pPICZaA-acrR,分别将重组表达质粒转化进毕赤酵母宿主菌GS115中,煮-冻-煮法提取重组酵母基因组,PCR法进行阳性基因整合酵母的筛选,1%琼脂糖凝胶电泳结果显示acrA、acrR基因已整合入GS115染色体上,PCR产物的分子量分别约为1.8Kb、1.2Kb。本试验获得的临床分离的不同源性大肠杆菌耐药基因acrA、大肠杆菌多重耐药调控基因acrR进行核苷酸与氨基酸序列同源性比较分析的结果,可为深入研究其AcrAB-TolC外输泵的调控机制提供参考;构建好的acrA、acrR基因的毕赤酵母表达载体,将为进一步诱导其在毕赤酵母中表达、制备其抗体,建立快速有效的该基因表达水平检测方法,阐明我国临床分离动物源性大肠杆菌的多重耐药机制奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 文献综述
• 1.1 大肠杆菌的耐药性分子机制
• 1.2 细菌的药物外输机制
• 1.3 大肠杆菌ACRAB-TOLC外输泵系统
• 1.4 大肠杆菌ACRAB-TOLC外输泵引起不同类药物的作用机制
• 1.5 大肠杆菌ACRAB-TOLC外输泵表达水平的调控机制
• 1.6 大肠杆菌多重耐药基因ACRA和ACRR的研究进展
• 第二章 实验内容
• 实验一 大肠杆菌ACRA与ACRR基因的克隆与序列分析
• 实验二 大肠杆菌ACRA基因与ACRR基因真核表达载体的构建
• 结论
• 参考文献
• 附表
• 致谢
• 作者简介