Sr18菌杀线虫产物发酵工艺放大及活性组分的研究

论文摘要

植物寄生线虫病害对农、林业的发展构成了严重的威胁,为达到治理线虫和保护环境的双重目的,利用微生物代谢产物研制线虫生防制剂成为了当今的研究热点。丝状真菌Sr18的代谢产物具有杀线虫活性强、杀线虫谱广、耐热、水溶性等特点,是一株极具开发前景的线虫生防菌。本论文对Sr18菌杀线虫代谢产物进行了30L以上规模的发酵工艺放大,并在原有分离研究的基础上重点对代谢产物中中性活性组分的分离方法进行了研究探索,主要研究成果如下:1.Sr18菌杀线虫代谢产物30L以上规模的发酵放大在摇瓶水平上,比较分析了不同培养基组分对Sr18菌菌体形态及其代谢产物杀线虫活性的影响。结果表明,以马铃薯为氮源并添加0.2%麦芽精可形成直径3～4mm的乳黄色光滑菌球,其杀线活性最高,以蛋白胨为氮源时可形成有刺大菌球并产生在中性介质中具有极高杀线活性的物质。在原有摇瓶及5L罐发酵的基础上,对Sr18菌株在30L罐中产生杀线虫代谢产物的发酵工艺进行了优化,确定的工艺参数为:一级种子静置培养24h,接种体积分数为4%,通气量1:0.35～1,控制溶氧20%～30%,发酵周期48h左右。在该条件下,所得发酵液的滤液1/2浓度杀线率可达95%左右。对Sr18菌30L罐发酵过程中不同时间内的菌丝形态进行了动态的观察和研究,结果表明:发酵初期（0～8h）以菌丝的营养生长为主,发酵中后期（40～60h）代谢产物逐渐分泌,且不断增加,此时大量晶体黏附在菌丝上,伴随晶体的分泌,杀虫活性逐渐增强。以通气量控制溶氧水平为20%～30%为原则进行工艺放大,初步确定了200L及5t罐发酵的各项工艺参数。经200L及5t发酵罐放大培养所得发酵液的滤液1/2浓度杀线率可达100%,5t罐所得发酵液的滤液1/4浓度杀线率也可达80%以上,为今后实现该菌活性代谢物的工业化生产奠定了一定的基础。2.Sr18菌杀线虫代谢产物的中性活性组分分离本论文对Sr18菌代谢产物中的中性组分分离方法进行了反复的摸索,建立了Sr18菌代谢产物中具杀线活性的中性组分的分离纯化路线:Sr18菌发酵液经离子交换树脂层析除酸后,得到pH7分离组分（杀线率49.95%）,该组分经大孔吸附树脂层析（乙醇梯度洗脱）及浓缩（5倍）后,可得到3个活性组分:未被吸附组分CⅠ（杀线率25.18%）、20%乙醇洗脱组分EⅠ（杀线率50.31%）及30%乙醇洗脱组分EⅡ（杀线率56.47%）。利用Sephacryl S-100分子筛层析对组分CⅠ、EⅠ、EⅡ进行分离,并利用冷冻干燥法对各分离组分进行浓缩（10倍）后检测各组分杀线活性,得到3个活性组分FⅠ（杀线率39.53%）、FⅢ（杀线率28.25%）、FⅥ（杀线率31.42%）。使用离子交换DEAE Sepharose Fast Flow凝胶,并采用分步洗脱方式:依次用50mL含0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液进行洗脱,对活性组分FⅠ进行分离后,使其进一步分离纯化,并得到三个分离组分DⅠ、DⅡ、DⅢ。实验结果为今后建立、完善Sr18菌代谢产物中活性物质的分离工艺提供了依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 植物寄生线虫的危害及防治方法
• 1.1.1 植物寄生线虫的危害
• 1.1.2 植物线虫病害防治现状及发展趋势
• 1.2 微生物杀线活性菌株的研究现状及存在问题
• 1.2.1 微生物资源的特点
• 1.2.2 研究现状及存在问题
• 1.3 线虫生防菌Sr18研究概况
• 1.4 本论文研究的主要内容及目的意义
• 2 Sr18菌杀线虫代谢产物发酵工艺放大
• 2.1 引言
• 2.1.1 发酵形式
• 2.1.2 发酵工艺的优化
• 2.1.3 实验思路、内容和意义
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.1.1 菌种
• 2.2.1.2 供试线虫
• 2.2.1.3 培养基
• 2.2.1.4 主要试剂
• 2.2.1.5 主要仪器设备
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 Sr18菌活化培养
• 2.2.2.2 孢子悬液的制备
• 2.2.2.3 Sr18菌摇瓶培养
• 2.2.2.4 30L发酵罐放大培养
• 2.2.2.5 生物量测定
• 2.2.2.6 pH测定
• 2.2.2.7 生物活性测定
• 2.2.2.8 菌株生长和杀线虫活性物质形成的动态曲线绘制
• 2.2.2.9 光镜（LM）样品的制备及光镜观察
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 培养基组分对Sr18菌菌体形态及杀线虫活性的影响
• 2.3.1.1 氮源对菌体形体和杀线活性的影响
• 2.3.1.2 蛋白胨浓度对菌体形体和杀线活性的影响
• 2.3.1.3 添加麦芽精对菌体形体和杀线活性的影响
• 2.3.1.4 小结
• 2.3.2 Sr18菌杀线虫代谢产物30L罐发酵放大条件的优化
• 2.3.2.1 接种量对Sr18菌产杀线虫代谢物的影响
• 2.3.2.2 种子培养方式对Sr18菌产杀虫代谢物的影响
• 2.3.2.3 溶解氧对Sr18菌产杀虫代谢物的影响
• 2.3.2.4 培养时间对Sr18菌产杀虫代谢物的影响
• 2.3.2.5 小结
• 2.3.3 Sr18菌30L罐发酵过程中菌丝形态的动态观察和研究
• 2.3.3.1 丝状真菌生长过程的一般规律
• 2.3.3.2 30L罐发酵过程中菌体形态的观察及分析
• 2.3.3.3 30L罐发酵过程中菌丝形态的LM观察及分析
• 2.3.3.4 菌丝分泌晶体情况的LM观察及分析
• 2.3.3.5 小结
• 2.3.4 Sr18菌杀线虫代谢产物200L及5t罐发酵放大的研究
• 2.3.4.1 200L罐发酵放大
• 2.3.4.2 5t罐发酵放大
• 2.3.4.3 小结
• 2.4 本章小结
• 3 Sr18菌杀线虫代谢产物的中性活性组分分离
• 3.1 引言
• 3.1.1 真菌杀线虫代谢产物中活性物质的研究概况
• 3.1.2 未知物剖析方法
• 3.1.3 常用生物分离技术
• 3.1.4 实验思路、内容和意义
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.1.1 主要材料
• 3.2.1.2 主要试剂
• 3.2.1.3 主要仪器设备
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 发酵滤液超滤分级
• 3.2.2.2 离子交换树脂层析除酸
• 3.2.2.3 未知组分的定性检测
• 3.2.2.4 大孔吸附树脂层析分级
• 3.2.2.5 分子筛层析
• 3.2.2.6 组分纯度的HPLC法鉴定
• 3.2.2.7 微晶纤维素薄层层析
• 3.2.2.8 微晶纤维素柱层析
• 3.2.2.9 离子交换凝胶层析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 发酵滤液超滤分级
• 3.3.2 离子交换树脂层析除酸
• 3.3.3 大孔吸附树脂层析分级
• 3.3.4 分子筛层析分离
• 3.3.4.1 凝胶外水体积的测量结果
• 3.3.4.2 流动相的选择
• 3.3.5 组分纯度的HPLC法鉴定
• 3.3.6 微晶纤维素柱层析
• 3.3.6.1 薄层层析
• 3.3.6.2 柱层析
• 3.3.7 离子交换凝胶层析
• 3.4 本章小结
• 4 全文总结与展望
• 4.1 总结
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录