“Gene Deletor”技术和果实无核基因转化柑橘的初步研究

论文摘要

柑橘是世界上最重要的水果之一。转基因育种是常规育种的重要辅助手段,成为实现目标性状改良的一种快速、有效的途径。但人们担心标记基因的环境和食品等安全性问题。"Gene-Deletor"技术（外源基因清除技术）是有望解决转基因植物环境安全性和食品安全性问题的有力工具。对于柑橘这类水果,种子是不受欢迎的特性,改良这些品种,实现无核化可提高其市场竞争力。因此,本试验从美国康涅狄格大学李义教授实验室引进的‘’Gene-Deletor"技术和果实无核化技术的相关基因和植物组织特异性启动子,应用于柑橘品种上,建立稳定再生及遗传转化体系,为建立完善的柑橘外源基因清除技术和果实无核化技术打下基础。本研究采用农杆菌介导法,以"Gene Deletor"技术基因载体及其对照基因载体和果实无核化基因载体分别转入到实生态金柑和成年态冰糖橙中,采用GUS组织染色和PCR等技术进行转基因植株的早期鉴定,以期获得两种技术的柑橘转基因株系。主要研究结果如下：1.建立金柑实生苗茎段上胚轴切段不定芽的再生体系。结果表明：采用35 d苗龄的无菌苗上胚轴节间茎段,水平放置在MS+N6-苄氨基嘌呤（6-BA）2.0 mg/L+α-萘乙酸（NAA）1.0mg/L+激动素（KT）1.0mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂（pH5.7）再生培养基上,经过3d暗培养,转移至光／暗周期16／8h条件下,为诱导金柑不定芽再生的最佳条件。2.通过金柑实生态茎段对卡那霉素敏感性试验的分析,在金柑遗传转化中,为获得一定数量的抗性芽,同时又淘汰大量的非转化体,确定卡那霉素筛选浓度为50 mg/L。3.利用金柑实生苗上胚轴切段和成年态冰糖橙节间茎段进行遗传转化。Gene-deletor技术载体Y-A及及其对照载体C-F,无核技术载体C-D。通过转化金柑实生态节间茎段,GUS染色和PCR进行早期鉴定转化金柑实生态获得的再生抗性芽,结果表明：1株转Y-A,3株转C-D和1株转C-F基因载体抗性植株成功导入目的基因。通过PCR早期鉴定转化成年态冰糖橙节间茎段获得的再生抗性芽试管苗,结果表明：5株转Y-A基因株系成功导入目的基因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 前言
• 1 问题的提出
• 2 无选择标记转化的研究进展
• 2.1 培育无选择标记转基因植的方法
• 2.2 "Gene Deletor"技术
• 2.2.1 "Gene Deletor"技术的基本原理
• 2.2.2 "Gene Deletor"技术的优点
• 2.2.3 "Gene Deletor"技术的应用
• 3 柑橘无核育种研究进展
• 3.1 柑橘无核化的生理机理
• 3.1.1 雄性不育
• 3.1.2 雌性不育
• 3.2 基因工程无核化的研究进展
• 3.2.1 雄性不育基因工程
• 3.2.2 单性结实基因工程
• 3.3 雄性不育与单性结实共同作用实现无核化
• 4 金柑转基因研究进展
• 4.1 金柑再生体系的建立
• 4.2 金柑遗传转化体系的建立
• 4.3 转基因检测体系
• 4.3.1 GUS检测、PCR和Southern blotting检测
• 4.3.2 应用MPCR方法早期检测转基因抗性芽和植株
• 4.3.3 应用TDNA侧翼序列分析早期鉴定转基因植株
• 4.3.4 遗传转化体系的应用
• 5 本研究的目的及意义
• 第二章 金柑高效离体再生体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 无菌苗的获得
• 1.2.2 外植体放置方式的确定
• 1.2.3 最佳外植体苗龄和再生培养基的确定
• 1.2.4 最佳暗培养时间的确定
• 1.2.5 茎尖嫁接再生成苗
• 2 结果与分析
• 2.1 外植体放置方式对金柑不定芽再生的影响
• 2.2 不同再生培养基及苗龄对金柑不定芽再生的影响
• 2.3 不同暗培养时间对金柑不定芽再生的影响
• 2.4 嫁接成苗
• 3 讨论
• 第三章 农杆菌介导"Gene Deletor"技术和果实无核基因转化金柑
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 供试品种、砧木
• 1.1.2 农杆菌菌株与质粒
• 1.2 试验材料
• 1.2.1 主要的生化试剂
• 1.2.2 主要仪器
• 1.3 主要培养基配方
• 1.4 试验方法
• 1.4.1 农杆菌EHA105感受态的制备
• 1.4.2 转化农杆菌EHA105
• 1.4.3 转化外植体的获得
• 1.4.4 菌液的制备
• 1.4.5 外植体卡那霉素敏感性试验
• 1.4.6 对照材料的获得
• 1.4.7 外植体的转化
• 1.4.8 遗传转化的因素分析
• 1.4.9 抗性芽再生成苗
• 1.4.10 抗性植株的GUS检测
• 1.4.11 GUS阳性植株PCR检测
• 2 结果与分析
• 2.1 卡那霉素对金柑不定芽再生的影响
• 2.2 遗传转化效率的因素分析
• 2.2.1 农杆菌侵染时间
• 600值'>2.2.2 农杆菌菌液OD₆₀₀值
• 2.3 抗性芽茎尖嫁接
• 2.4 GUS检测分析
• 2.5 GUS阳性植株PCR检测分析
• 3 讨论
• 第四章 农杆菌介导"Gene Deletor"技术基因转化冰糖橙
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 主要的生化试剂及仪器
• 1.1.3 农杆菌菌株与质粒
• 1.2 方法
• 1.2.1 成年态外植体准备
• 1.2.2 外植体传化
• 1.2.3 抗性芽的再生
• 1.2.4 抗性植株的PCR检测
• 2 结果与分析
• 2.1 抗性芽的获得
• 2.2 嫁接成苗
• 2.3 抗性植株的PCR检测分析
• 3 讨论
• 全文总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历