SiRNA靶向沉默EGFR基因对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响

论文摘要

目的：构建靶向人EGFR基因的RNAi慢病毒载体并体外转染人胰腺癌细胞株Panc-1,观察抑制效果。探讨慢病毒介导RNAi沉默EGFR基因在胰腺癌基因治疗中的应用前景,以开辟胰腺癌治疗的新途径。方法：1.构建慢病毒表达载体LV-shEGFR,阳性克隆测序鉴定。2.用LV-shEGFR与pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G三种质粒共转染293T细胞,包装与纯化产生慢病毒颗粒及病毒滴度测定。3.将获得的病毒感染胰腺癌细胞株Panc-1细胞,用Real-time PCR及Western-blot检测细胞中EGFR基因的表达。实验分为Panc-1组（空白组）、GFP-Panc-1组（对照组）及SiEGFR-Panc-1组（干扰组）共三组。4.采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测细胞增殖情况,流式细胞仪（FCM）分析细胞周期以及细胞凋亡,探讨携带目的基因病毒转染对胰腺癌细胞生物学行为的影响。结果：1.LV-shEGFR的克隆测序得到正确的结果,阳性克隆鉴定测序结果如下：CGCAAAGTGTGTAACGGAATA插入片断位于95-115bp。2.大量包装与纯化后病毒滴度为2×108TU/ml。3.Real-time PCR检测慢病毒感染Panc-1后EGFR基因沉默效果,干扰组抑制率达80%;Western blot法检测显示,干扰组靶细胞EGFR蛋白表达抑制明显,蛋白条带明显变细、变浅,相对表达量显著下降。4.干扰组细胞生长速度明显慢于空白及GFP组细胞,差异有统计学意义（P<0.05）。三组细胞经过流式细胞仪检测,干扰组凋亡率为（18.4±2.29）%明显高于GFP对照组（7.361.38）%和空白组（7.72±1.15）%,差异有统计学意义（P<0.05）。干扰组使细胞G2/M期细胞数减少,S期细胞数比例增加差异有统计学意义（P<0.05）。结论：1.慢病毒是携带SiRNA进入胰腺癌细胞的理想载体。2.携带SiEGFR慢病毒可以获得较高的滴度。3.携带SiEGFR慢病毒转染Panc-1细胞后,EGFR在mRNA及蛋白水平被显著沉默。4.携带SiEGFR的慢病毒载体对胰腺癌细胞Panc-1的生长和增殖有明显的抑制作用,并能提高胰腺癌细胞Panc-1凋亡率。

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