人钠碘转运体基因转染胶质瘤细胞介导放射性碘治疗的体外研究

论文摘要

目的：胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，呈浸润性生长，无明显界线，手术很难完全切除；化、放疗既不能高度特异性的杀伤胶质瘤细胞，治疗效果差，又可能产生中枢神经系统及全身不能耐受的毒副作用。迄今为止，胶质瘤常规治疗方法，疗效不理想，预后差，病死率高。治疗现状堪忧，有待新型安全高效的治疗手段出现。放射性碘治疗甲亢和部分分化良好的甲状腺癌是临床常规方法，疗效肯定。其机制是将放射性核素经口服途径引入机体，在体内其与普通碘元素一样参与参与机体的代谢过程，并选择性浓聚于有摄碘能力的组织器官中，131I的衰变过程中能释放出β射线，在病变组织中产生一系列的辐射生物效应，通过辐射能的直接和间接作用，使细胞代谢发生紊乱最终导致细胞死亡。放射性核素治疗与药物治疗有所不同，由于核素发出射线有一定的射程，因此它杀伤的不是单个细胞，而是细胞团。于是，我们设想如果将转基因技术与放射性碘治疗相结合，将hNIS基因转染至胶质瘤细胞中，使原本不摄碘的胶质瘤细胞摄取碘。然后利用放射性核素——131I的辐射生物效应，干扰胶质瘤细胞的生物代谢，抑制肿瘤细胞增值活性，最终使癌细胞死亡的目的。本研究的目的就是探讨在胶质瘤细胞系U251中使用脂质体转染法将hNIS基因引入的可能性，及获得稳定表达细胞系后在131I作用下，肿瘤细胞生物活性的改变，为体外裸鼠实验收集可靠的实验数据，为将来的胶质瘤基因治疗奠定理论基础。方法：鉴定已构建好的重组质粒（pcDNA3.1-hNIS）。使用脂质体转染法利用重组质粒将hNIS基因转染入人胶质瘤细胞系U251中，使胶质瘤细胞获得hNIS基因；经过G418抗生素筛选获得稳定表达hNIS的细胞系（hNIS-U251），同时设立对照转组；进行转染后稳定表达细胞系的四唑盐分析（MTT分析），细胞克隆形成实验，流式细胞仪测定细胞生物周期及凋亡，体外摄125I实验及过氯酸盐抑制实验；体外125I反流实验，体外125I内流实验，并绘制时间一每分钟放射性计数曲线等。结果：1．以BqlⅡ单酶切并电泳鉴定酶切产物，结果显示重组质粒（pcDNA3.1-hNIS）在5502bp和1922bp有两清晰电泳条带，与理论计算结果相符合，可以证实本次质粒确实为重组质粒（pcDNA3.1-hNIS）。2．使用脂质体转染法转染hNIS基因后，经G418筛选后获得稳定表达细胞系（hNIS-U251），其G418耐受浓度为900μg／ml；获得稳定表达转染细胞系（pcDNA3.1+-U251），其G418耐受浓度为700μg／ml；空白对照组细胞系（U251）完全没有G418抗性。3．瞬时表达hNIS的U251细胞的摄125I能力测定：使用脂质体转染24h后，hNIS在U251细胞系中有瞬时表达，实验组（hNIS-U251）分别比较阴性对照组（pcDNA3.1+-U251）和空白对照组（U251）的摄125I能力增高约4倍左右（P＜0.01）。4．稳定表达细胞系（hNIS-U251）的摄125I能力测定：实验组（hNIS-U251）比较阴性对照组（pcDNA3.1+-U251）的摄125I能力增高约106倍左右（P＜0.01），实验组（hNIS-U251）比较空白对照组（U251）的摄125I能力增高约117倍左右（P＜0.01）。5．125I内流的动态演变实验：125I在实验组（hNIS-U251）稳定表达细胞系中快速聚集，约90-120min时达到稳定阶段；空白对照组（U251）没有125I的聚集。6．125I外流的动态演变实验：实验组（hNIS-U251）在环境中撤掉125I后，细胞中的125I会发生快速外流；实验组（hNIS-U251）中125I的生物半衰期为7min，有效半衰期为7min。7．过氯酸盐抑制实验：没有加入NaClO4的hNIS-U251细胞系的有摄125I能力，加入NaClO4的hNIS-U251细胞系的摄125I能力明显受到抑制，摄碘能力降低30倍左右（P＜0.001），证明hNIS-U251的摄碘功能确实为hNIS基因的功能。8．细胞克隆实验结果表明：实验组（hNIS-U251）比未经125I孵育的实验组的克隆形成率有所降低（P＜0.01），约降低10倍左右：而未经125I孵育的实验组（hNIS-U251）比对照组（U251）的细胞克隆形成率未见明显差异（P=0.82）。9．MTT实验：检测125I是否可以抑制实验组（hNIS-U251）的增值活性，结果表明：实验组比较对照组的细胞增值率虽然仍保持较高的水平，与对照组细胞增值率有所降低（P＜0.01）。10．采用FSM测定稳定表达细胞的S期细胞比率和增值指数：实验组细胞的增值活性随着131I的孵育时间延长而降低（P＜0.01），对照组的细胞的增值活性在131I孵育后也有所降低（P＜0.01）。但是对比实验组，还是实验组更低（P＜0.01）。结论：本研究使用质粒将hNIS基因转染入不摄碘的胶质瘤细胞系U251中，使原来不摄碘的胶质瘤细胞摄碘，然后利用放射性碘元素的辐射生物效应，使肿瘤细胞死亡。本研究在体外条件下证明转染hNIS基因并介导131I治疗胶质瘤的可能性。结果表明：1．在使用质粒转染hNIS基因到U251细胞中后，可以成功的获得稳定表达hNIS基因的胶质瘤细胞系（hNIS-U251）。2．稳定表达细胞系hNIS-U251可以摄取碘，而且这种摄碘的能力是由hNIS基因介导的，转染后的hNIS基因是有功能的。细胞系hNIS-U251的摄碘能力可以大大提高，大约提高110倍左右。3．在稳定表达hNIS基因的细胞系hNIS-U251中碘的内流的过程是快速的，大约在90-120min达到平衡状态。hNiS-U251细胞系在环境中的碘去除后，不能有效的储留碘，细胞内的碘快速的外流，碘的半衰期短。4．hNIS-U251细胞系在131I孵育后，细胞克隆形成率明显下降，大约下降10倍左右；细胞系的增值活性随着131I的孵育时间延长而降低，而相同孵育时间条件下，hNIS-U251细胞系的增值活性要低于U251细胞系。这说明：131I确实可以有效的杀伤肿瘤细胞。

论文目录

• 一、英文缩略表
• 二、论文
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 三、致谢
• 四、综述