键合磷酸锆开管毛细管柱制备及富集磷酸肽方法研究

论文摘要

蛋白质磷酸化是生物体内最重要的翻译后修饰之一,与细胞的许多生命活动如信号转导,细胞通讯、分化、增殖、代谢等密切相关。研究分析生物体内蛋白质的磷酸化对于认识这些生理过程具有非常重要的意义。由于磷酸化蛋白在生物体内含量很低,且在质谱分析时易受到非磷酸肽的干扰,因而磷酸肽和磷酸化蛋白质的富集成为磷酸化肽和磷酸化蛋白质分析的一个关键步骤。目前已经有很多富集磷酸肽的方法和技术,但这些方法在应用时仍然存在不少问题,因而需要发展新的富集方法,以满足大规模磷酸化蛋白质组分析的需要。基于此,本课题开展了一种磷酸肽富集的新方法研究,并将其应用于复杂样品的分析。本课题发展的方法为一种利用键合磷酸锆开管毛细管柱的制备及用于快速富集磷酸肽的新方法。其过程是通过酸碱活化熔融石英毛细管内表面,使其带有自由的硅羟基,然后对硅羟基进行氨基修饰、磷酸基团修饰并与锆离子生成磷酸盐,最终合成具有特异性吸附磷酸肽分子的开管毛细管柱。进一步采用正交实验对磷酸肽的富集条件进行了优化。确定出最佳柱径、柱长及进样流速分别为50μm,150cm和0.3μL/min,并考察了尿素、SDS和氯化钠对富集效果的影响。还用合成的磷酸肽段（FLpTEYVATR）与iTRAQ试剂相结合,对开管柱的富集效率,负载量和回收率等进行考察,确定出负载量32.52 pmol,回收率78.1%（150cm×50μm）。20次重复实验结果表明该功能化的开管毛细管柱性能稳定。利用α酪蛋白与BSA混合酶切溶液,考察了功能化毛细管开管柱的选择性和检测灵敏度,结果表明此方法对磷酸肽有较高的选择性,且检测限达到10-8M。在优化的实验条件下,利用牛α、β酪蛋白对功能化的开管毛细管柱的富集性能进行考察,实验结果显示α酪蛋白的理论磷酸化位点覆盖率达到90.9%,β酪蛋白覆盖率为100 %。最后,通过将所建富集和质谱鉴定方法用于牛奶样本中磷酸化蛋白质的富集和分析,结果表明此功能化的开管毛细管柱可以有效用于复杂样本中的磷酸化肽的富集并提高其质谱鉴定效率。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 蛋白质磷酸化意义
• 1.2 磷酸化蛋白质分析策略
• 1.2.1 蛋白质水平上的磷酸化富集策略
• 1.2.2 肽段水平上的磷酸化富集策略
• 1.2.3 磷酸肽质谱鉴定
• 1.3 本论文研究意义
• 第二章 键合磷酸锆开管毛细管柱的制备及磷酸肽的富集
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂与材料
• 2.2.2 标准蛋白质酶切
• 2.2.3 仪器与设备
• 2.2.4 键合磷酸锆开管毛细管柱的制备
• 2.2.5 键合磷酸锆开管毛细管柱富集磷酸肽
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 α酪蛋白的富集
• 2.3.2 β酪蛋白的富集
• 2.4 本章小结
• 第三章 键合磷酸锆开管毛细管柱富集条件优化
• 3.1 前言
• 3.2 柱径、柱长和进样流速对富集的影响
• 3.2.1 正交实验
• 3.2.2 结果讨论
• 3.3 尿素、SDS及盐对富集的影响
• 3.3.1 实验
• 3.3.2 结果讨论
• 3.4 本章小结
• 第四章 键合磷酸锆开管毛细管柱的富集性能评价
• 4.1 前言
• 4.2 试剂与材料
• 4.3 锆离子富集性能考察
• 4.4 键合磷酸锆开管毛细管柱使用稳定性评价
• 4.5 选择性和检测限
• 4.6 负载量和回收率
• 4.6.1 iTRAQ试剂标记原理
• 4.6.2 iTRAQ试剂标记实验
• 4.6.3 结果与讨论
• 4.7 本章小结
• 第五章 键合磷酸锆开管毛细管柱在复杂体系中的应用
• 5.1 前言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 牛奶复杂样本的酶切
• 5.2.2 仪器与设备
• 5.2.3 键合磷酸锆开管毛细管柱用于牛奶复杂样本的富集
• 5.3 结果与讨论
• 5.4 本章小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 致谢