产脂肪酶菌株的筛选、鉴定及产酶条件优化

论文摘要

从海口市各地采集含油污土样10份,富集培养得到产脂肪酶细菌优势菌种,梯度稀释后,以花生油为唯一碳源采用油脂固体平板透明圈法进行分离纯化,得到145株产脂肪酶的菌株。再经摇瓶复筛,获得两株产脂肪酶活力较高的菌株,编号分别为C737-11和C7828-5。按照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》（2004版）的方法对两株菌进行了生理生化鉴定,以及结合分子生物学鉴定,确定菌株C737-11为洋葱伯克霍尔德氏Ⅰ型菌,菌株C7828-5为铜绿假单胞菌。菌株C737-11粗酶的最适作用温度为37℃,最适pH值为8.0,初步优化了C737-11的产脂肪酶条件,获得高达10.5 U mL-1的脂肪酶活性。应用单因子试验和正交实验对铜绿假单胞菌C7828-5产脂肪酶发酵培养基进行了快速优化。首先应用单因子试验确定铜绿假单胞菌C7828-5产脂肪酶最适碳源和最适氮源分别是花生油和蔗糖组合及牛肉膏。在此基础上通过L9（34）正交试验,考察了花生油、蔗糖、牛肉膏、硫酸铵等四个因素对产酶的影响,获得优化的培养基组成。最后通过单因子试验确定最适发酵温度、最适起始pH、最适接种量及最适摇床转速等。试验获得的优化培养条件为：蔗糖5gL-1、牛肉膏20 g L-1、（NH4）2SO4 1 g L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、CaCl20.5gL-1,聚乙烯醇花生油乳化液120 mLL1,起始pH7.0,培养温度28℃,转速为200 r min-1,培养72h后,获得高达8.08 U mL-1的脂肪酶表达量。对菌株的发酵粗酶液进行了酶学性质探讨,结果表明菌株C737-11和C7828-5脂肪酶的最适作用温度和最适作用pH分别都是37℃和8.0,都属于中温弱碱性酶。菌株C737-11脂肪酶热稳定性良好,50℃处理60 min后还有82%的酶活力；60℃处理40 min后还有55%的酶活力；70℃处理20 min后还有63%的酶活力；该脂肪酶在pH6.0-8.0范围内具有较好的稳定性,不过,在强碱性条件下（pH9-10）,该酶稳定性较差。菌株C7828-5脂肪酶60℃处理1 h后酶活力几乎丧失,在pH 5.0-10.0范围内具有较好的稳定性,而且在中性条件下（pH 7.0）,该酶酶活性仍保持不变,pHH10.0温浴1 h后仍有45%的酶活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 脂肪酶的简介
• 1.1.1 脂肪酶的分子结构及特征
• 1.1.2 脂肪酶的作用机理
• 1.2 产脂肪酶的微生物
• 1.3 产脂肪酶菌的筛选方法
• 1.4 脂肪酶活性测定方法
• 1.4.1 碱滴定法
• 1.4.2 PNPB法
• 1.4.3 皂铜法
• 1.5 脂肪酶活性的影响因素
• 1.6 生物柴油概述
• 1.6.1 生物柴油研究现状
• 1.6.2 生物柴油的制备方法
• 1.6.2.1 直接混合法
• 1.6.2.2 热解法
• 1.6.2.3 微乳化法
• 1.6.2.4 酯交换法
• 1.6.3 生物柴油的发展趋势
• 1.6.3.1 国外生物柴油的进展
• 1.6.3.2 国内生物柴油的进展
• 1.7 本课题的研究目的与意义
• 1.8 创新
• 1.9 本研究的技术路线
• 2 实验材料、试剂及仪器
• 2.1 材料
• 2.2 试剂
• 2.2.1 购买试剂
• 2.2.2 配制试剂
• 2.3 主要仪器设备
• 2.4 培养基
• 3 实验方法
• 3.1 产脂肪酶菌株的筛选
• 3.1.1 富集培养
• 3.1.2 平板分离
• 3.1.3 产脂肪酶菌株的复筛
• 3.1.4 脂肪酶产生菌的保藏方法
• 3.1.5 脂肪酶活性的测定
• 3.2 菌株分类鉴定
• 3.2.1 革兰氏染色
• 3.2.2 固体平板上的菌落形态观察
• 3.2.3 运动性试验
• 3.2.4 不同温度对生长影响的测定
• 3.3 细菌的生理生化特征试验
• 3.4 16S rRNA序列分析
• 3.4.1 细菌基因组DNA的提取
• 3.4.2 16S rRNA基因的扩增及分析
• 3.5 Fur基因序列分析
• 3.5.1 B.cepacia全基因组DNA提取
• 3.5.2 Fur基因扩增及分析
• 3.5.3 PCR产物的克隆
• 4 结果与分析
• 4.1 菌株筛选
• 4.2 菌株的鉴定
• 4.2.1 菌株C737-11的鉴定
• 4.2.1.1 形态学、生理生化特征
• 4.2.1.2 分子生物学鉴定
• 4.2.2 菌株C7828-5的鉴定
• 4.2.2.1 形态学、生理生化特征
• 4.2.2.2 分子生物学鉴定
• 4.3 产酶条件优化
• 4.3.1 C737-11菌株的产酶条件优化 #36.
• 4.3.1.1 碳、氮源优化
• 4.3.1.2 不同起始pH对产酶的影响
• 4.3.2 C7828-5菌株的产酶条件优化
• 4.3.2.1 菌株生长产酶培养基优化
• 4.3.2.2 金属离子对产酶的影响
• 4.3.2.3 菌株产酶条件优化
• 4.4 酶学性质研究
• 4.4.1 C737-11脂肪酶的酶学特性
• 4.4.1.1 酶反应最适温度
• 4.4.1.2 酶反应的最适pH
• 4.4.1.3 酶的热稳定性
• 4.4.1.4 酶的pH稳定性
• 4.4.2 C7828-5脂肪酶的酶学特性
• 4.4.2.1 酶反应的最适温度
• 4.4.2.2 酶反应的最适pH
• 4.4.2.3 酶的热稳定性
• 4.4.2.4 酶的pH稳定性
• 5 讨论
• 5.1 脂肪酶产生菌的筛选
• 5.2 菌株的鉴定
• 5.3 脂肪酶活力测定方法的选择
• 5.4 菌株的产酶条件优化
• 5.5 脂肪酶的酶学性质
• 6 结论
• 7 存在的问题与讨论
• 参考文献
• 致谢