家蚕SSR分子遗传图的构建及基因定位的研究

论文摘要

本研究构建了平均插入片段为7kb的家蚕随机基因组文库,共挑取244,000个克隆,覆盖3.9×家蚕基因组。通过用同位素标记的（CA）15和（CT）15寡核苷酸探针对文库进行杂交筛选,总共得到13,600个含SSR序列的阳性克隆。对阳性克隆用进行二次测序得到SSR位点两侧的序列,并根据这些序列设计了2700对引物。将这些引物在六个家蚕品系:大造,C108,菁松,兰10,54A及F50B中扩增并进行多态性分析,发现SSR标记在这六个品系间的多态率为16.9-24%,与其它物种相比要低很多,表明了家蚕品种间的高度纯合性;同时筛选出了555对在家蚕品种大造与C108间具有多态性的SSR引物。以大造和C108为亲本,构建了含189个体的F1作雄回交（BC1M）作图群体,并将上述555个多态性SSR标记在此群体中进行基因型分析（Genotyping）。得到的数据经Mapmaker软件以参数:LOD=5.0,最大交换值为0.25作图,得到了一张含29个连锁群的图谱,与家蚕的28条染色体相比多出一条。然后将图上的标记经BC1F群体进行连锁验证,证明了连锁关系的正确性,同时确定图谱中的第10及14连锁群来自相同的染色体,进而整合形成了一张含28个连锁群的遗传图。之后根据已定位可见突变基因所配制的39个BC1Fx群体进行基因型分析,确定了28个连锁群的标记与这些形态标记的连锁关系,从而将此28连锁群与家蚕经典形态标记遗传图中的连锁群编号一一对应。为了进一步验证染色体整合的结果,我们还开发了12个来源于已定位基因的CAPS标记,并通过对这些CAPS标记在图上的定位以将SSR连锁群与形态标记连锁群整合。最后构建成一张含518个SSR标记,29个CAPS标记,1个形态标记的家蚕SSR遗传图。根据已经构建的SSR连锁图,对家蚕的三个绿茧基因:互补基因Ga和Gb,以及显性基因Gc进行了定位。对Ga和Gb基因的定位采用了以w07和C108为亲本的回交群体,对Gc基因的定位采用了以大造和i04为亲本的回交群体。在Ga-Gb的定位中,发现了三种表型:绿茧,浅绿色茧及白茧,其分离比为1:1:2。表明可能在GaGb体系的茧色成因中可能有一种类似于渗透作用的色素运输途径。Ga, Gb和Gc被分别定位到了家蚕连锁群20,28和28上,与这三个基因最近的标记分别与其相距0cM,2.2cM和4.1 cM。此外还对家蚕的自然黑蛾突变（mln,melanism）基因进行了定位,定位所用的亲本为大造和i04,通过BC1F回交群体的基因型分析,发现mln与18号连锁群上的标记连锁,并根据BC1M群体进行基因型分析,将mln基因定位在18号连锁群的45 cM处,

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1. 家蚕分子遗传图谱的研究进展
• 1.1 理论基础
• 1.2 构建遗传图谱的两个基本要素
• 1.2.1 作图群体
• 1.2.2 遗传标记
• 1.3 遗传图谱的构建方法
• 1.3.1 筛选具多态性的分子标记位点
• 1.3.2 基因型分析及标记分离数据的收集与处理
• 1.3.3 标记位点的连锁测验（连锁的两点检验）
• 1.3.4 重组值的估计
• 1.3.5 多点分析与基因的直线排序
• 1.3.6 交换干扰与作图函数（Mapping function）
• 1.3.7 分子标记连锁群的染色体定位
• 1.4 分子连锁遗传图的作用
• 1.4.1 分子遗传图在分子标记辅助育种中的应用
• 1.4.2 分子遗传图谱在比较基因组作图中的应用
• 1.5 家蚕的遗传图谱
• 1.5.1 家蚕的经典遗传图
• 1.5.2 已构建的家蚕分子连锁图
• 1.5.3 家蚕的分子标记连锁图谱的比较
• 1.6 展望
• 2. 家蚕的基因定位及基因克隆
• 2.1 前言
• 2.2 基因定位
• 2.2.1 基因定位的主要方法
• 2.2.2 家蚕的基因定位
• 2.2.3 结论与展望
• 2.3 家蚕的基因克隆
• 2.3.1 基因克隆的主要技术
• 2.3.2 家蚕基因克隆的发展
• 2.3.3 前景与展望
• 参考文献
• 第二章 家蚕微卫星分子标记的开发
• 摘要
• 1. 引言
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 建库
• 2.2.2 SSR序列的杂交筛选
• 2.2.3 测序及引物设计
• 2.2.4 微卫星引物的PCR验证
• 2.2.5 PAGE电泳筛选多态性微卫星引物
• 3. 结果与分析
• 3.1 建库结果
• 3.1.1 DNA抽提
• 3.1.2 文库大小及覆盖率
• 3.2 杂交结果
• 3.3 测序及引物设计
• 3.4 大造验证结果
• 3.5 多态性引物筛选结果
• 4. 讨论
• 4.1 随机基因组文库的构建
• 4.1.1 大片段DNA抽提
• 4.1.2 两个文库的构建
• 4.2 微卫星标记的开发成本
• 4.3 家蚕中（CA）N及（CT）N微卫星序列的分布
• 4.4 SSR标记在家蚕6 品系间的多态性分布
• 参考文献
• 第三章 家蚕SSR分子标记连锁图的构建
• 摘要
• 1. 引言
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 亲本及多态性筛选品系
• 2.1.2 家蚕作图群体的设计
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 基因型分析（Genotyping）
• 2.2.2 MAPMAKER作图
• 2.2.3 验证连锁群中标记的连锁关系
• 2.2.4 与家蚕经典形态标记连锁群整合
• 3. 结果
• 3.1 GENOTYPING及MAPMAKER作图结果
• 3.2 连锁群的验证
• 3.3 染色体锚定结果
• 3.3.1 形态标记
• 3.3.2 CAPS标记
• 3.3.3 对一些未定位EST序列的CAPS标记定位
• 3.3.4 最终构建的遗传图
• 4. 讨论
• 4.1 实验方法
• 4.1.1 遗传群体的构建
• 4.1.2 使用377 测序仪进行高通量基因型分析（genotyping）
• 4.1.3 MAPMAKER作图参数
• 4.1.4 连锁群的验证
• 4.1.5 与家蚕经典连锁群整合
• 4.2 SSR遗传图的优点
• 4.2.1 SSR分子标记的优点
• 4.2.2 图谱的构建精确度和作图效率
• 4.3 SSR图谱的应用
• 4.3.1 基因定位
• 4.3.2 比较基因组的研究
• 5. 总结
• 参考文献
• 第四章 家蚕绿茧基因定位
• 摘要
• 1. 引言
• 2. 材料及方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 亲本
• 2.1.2 群体
• 2.2 方法
• 2.2.1 家蚕蛹的DNA提取
• 2.2.2 PCR反应及多态性标记的筛选
• 2.2.3 连锁关系的确定
• 2.2.4 基因型分析及作图
• 3. 结果
• 3.1 回交群体中的表型及分离比统计
• 3.2 确定GA,GB和GC基因的所在连锁群
• 3.3 GENOTYPING及对GA,GB和GC的定位
• 4. 讨论
• 4.1 作图群体中个体的选择
• 4.2 连锁分析与图谱构建
• 4.2.1 策略
• 4.2.2 连锁分析及GaGb的位置判定
• 4.2.3 基因定位及与SSR标记图谱的比较
• 4.2.4 与之前的定位相比较
• 4.2.5 浅绿茧的形成原因假说
• 4.2.6 对于定位克隆的意义
• 4.3 绿茧色素的健康作用
• 参考文献
• 第五章 家蚕黑色素基因MLN的定位
• 摘要
• 1. 引言
• 2. 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 亲本
• 2.1.2 群体设计
• 2.2 方法
• 2.2.1 家蚕成虫的DNA提取
• 2.2.2 PCR反应及多态性标记的筛选
• 2.2.3 连锁关系的确定
• 2.2.4 基因型分析及作图
• 2.2.5 标记51807 与51808 的BAC contig的构建
• 3. 结果
• 3.1 回交群体中的表型分离比
• 3.2 多态性标记的筛选,与连锁验证
• 3.3 BC1M群体的基因型分析及MLN 基因的定位
• 3.4 BAC CONTIG的构建
• 4. 讨论
• 4.1 连锁分析
• 4.2 MLN 基因的定位
• 4.3 BAC CONTIG的构建
• 参考文献
• 总结
• 发表文章目录
• 致谢