论文摘要
背景:恶性淋巴瘤严重威胁人类健康,复发、耐药及治疗相关的各种严重并发症的发生严重限制了其治愈率的明显提高。近年来逐渐兴起的全身免疫基因治疗,由于其高效、低毒、作用持久、对多发肿大淋巴结及淋巴瘤细胞浸润的器官组织均有抑制作用的优势,为B细胞淋巴瘤的治疗开辟了新思路。黑色素瘤分化相关基因7（melanoma differentiation associated gene7,MDA7）的蛋白表达产物IL-24（interleukine-24）具有多功能抗肿瘤效应,使其成为癌症基因治疗领域具有强大潜力的抗癌基因之一。在治疗载体选择方面,腺相关病毒载体,具有可长期稳定整合于宿主基因组、适于表达生物活性因子、抗原性小、病原性低、安全性高的优势。且腺相关病毒载体血清型VIII具有肌纤维细胞靶向整合的特性,通过选择该载体,利用肌肉组织遍布全身,肌纤维细胞数量巨大的特点,尝试单次肌肉注射方式治疗B细胞淋巴瘤的小鼠模型,观察疗效并逐一验证MDA7/IL-24抗B细胞淋巴瘤的机制。目的:构建表达MDA7/IL-24的腺相关病毒载体VIII（adeno-associated virus type 8）即AAV8-MDA7/IL-24。尝试采用单次肌肉注射的方式将目的基因整合于小鼠基因组中,观察其对B细胞淋巴瘤模型小鼠的疗效。并进一步深入探讨MDA7/IL-24抗B细胞淋巴瘤的作用机制。方法:（1）共转染方法制作和纯化表达MDA7/IL-24的腺相关病毒颗粒。（2）转导C2C12细胞后,收集含有IL-24蛋白的上清作用于淋巴瘤细胞,利用TUNEL法检测其体外诱导肿瘤细胞凋亡的能力。（3）尾静脉注射小鼠淋巴瘤细胞,建立BALB/C小鼠淋巴瘤模型。（4）将淋巴瘤模型小鼠随机分组,分别单次于股四头肌处注射对照组及实验组病毒颗粒,观察生存情况,并测量肿瘤直径大小。（5）每周取小鼠球后静脉血,ELISA法检测小鼠外周血中IL-24水平。（6）同时检测血清中IL-10,IL-6,TNFα,IFNγ,GM-CSF的水平。并分离单个核细胞,运用流式细胞仪检测外周血单个核细胞亚群变化。（7）TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡,CD31组化染色检测其抗血管新生能力。结果:（1）共转染293细胞并通过碘化醇超离心的方法可以获得高滴度的AAV8-MDA7/ IL-24病毒颗粒及对照组病毒颗粒AAV8-EGFP。（2）病毒体外转导C2C12细胞可以在体外分泌IL-24 （114.71±17.08ng/ml vs. 12.40±1.56ng/ml,P<0.001）。（3）病毒肌肉注射健康BALB/C小鼠,AAV8-MDA7/IL-24病毒颗粒可以在肌肉注射后于BALB/C小鼠体内持续高水平分泌（1W:59.8±5.33ng/ml vs.7.76±2.38ng/ml;2W:71.36±5.69ng/ml vs. 16.38±2.55ng/ml;4W:100.92±6.12ng/ml vs. 13.76±3.52ng/ml,P<0.001）。（4）尾静脉注射方式可以建立稳定的B细胞淋巴瘤小鼠模型。（5）ELISA方法检测AAV8-MDA7/IL-24治疗后模型小鼠,IL-24也可以或者持续高水平分泌（约60-70ng/ml,持续6w以上）。（6）治疗组小鼠能获得较长的生存期（65.6±5.8 vs. 47.4±4.8 days;P<0.03）,且4周后肿瘤细胞的负荷也有显著差异（4W:2.80×107±1.53×107vs.1.78×108±8.20×107 photon/sec ; 5W:1.32×108±2.30×107 vs. 2.63×108±6.50×107 photon/sec,P<0.05）。（7）IL-24可以诱导体外A20细胞的凋亡均较对照组有显著差异（30ng/ml:16.52±1.80%, P<0.05;50ng/ml:24.41±4.03%, P<0.01;100ng/ml:62.61±3.66%,P<0.001 vs.对照组:10.43±4.08%）,且呈剂量依赖性。也可以诱导体内肿瘤细胞的凋亡（51.18±2.44% vs.7.01±1.80%,P<0.001）。（8）IL-24抑制肿瘤组织内新生血管的增殖（8.42±2.8 vs. 15.25±4.8,P<0.03）。（9）在注射AAV8-MDA7/IL-24一周后,IL-24可以引起IL-6和IFN-γ的增高（IL-6: 137.17±22.4ng/ml VS 62.03±2.01ng/ml; IFN-γ: 43.07±15.36ng/ml VS 20.67±0.30ng/ml; P<0.01）（10）治疗组小鼠注射病毒7天和14天后,外周血单个核细胞中CD3+CD8+ T细胞及中性粒细胞有显著增高,而脾脏细胞中仅有巨噬细胞和中性粒细胞的增高（P<0.05）。结论:（1）AAV8-MDA7/IL-24体内外转导肌细胞均可以获得高水平的IL-24持续表达。（2）AAV8-MDA7/IL-24治疗后B细胞淋巴瘤小鼠可以获得较长的生存期和较小的肿瘤负荷。（3）单次肌肉注射AAV8-MDA7/IL-24可以在B细胞淋巴瘤小鼠获得高水平持续分泌的IL-24蛋白,并且可以引起IL-6和IFN-γ水平的增高。（4）IL-24可以在体内外都诱导淋巴瘤细胞凋亡。（5）IL-24抑制小鼠肿瘤组织内微血管的新生。（6）IL-24治疗7天和14天后可引起小鼠脾脏细胞及外周血单个核细胞的亚群变化。单次肌肉注射AAV8-MDA7/IL-24治疗B细胞淋巴瘤的小鼠模型,方法简单,疗效确切。为AAV8-MDA7/IL-24用于治疗人类B细胞淋巴瘤的治疗提供了临床前依据。
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