缺氧海马神经元中p53对其下游基因的调控

论文摘要

研究背景细胞在应对外界激刺激时,通过活化自身的信号通路,激活相关因子,促进基因转录,从而适应外界条件的转变,而p53是细胞在面对遗传毒性、非遗传毒性刺激时,细胞所激活的关键分子,其活化可激活不同类型靶基因,诱导细胞出现细胞周期停滞、凋亡、坏死等变化,同时参与DNA损伤修复。细胞内对p53的调控主要是通过转录后修饰,当细胞受到DNA损伤,缺氧和高温等刺激时,MDM2催化的泛素蛋白酶体依赖的降解通路受到抑制,从而导致p53降解以及其从核内的转出减少,核内p53聚集,进而诱导或抑制其下游调控细胞周期停滞、细胞凋亡的靶基因转录,最终产生对应于相应生理应激的细胞反应。目前的研究显示p53的活化受细胞种类,刺激形式和细胞周围环境等多方面因素的影响,即对应不同的刺激信号p53激活不同组合的下游靶基因。缺氧是一种重要的生理刺激,在正常发育和肿瘤形成以及转移中都担任着重要的角色。严重缺氧时可以引起胞内p53的积累,从而引起细胞凋亡。与其他引起DNA断裂的胞外刺激不同,缺氧活化的p53几乎没有转录激活功能,而是以转录抑制功能为主。中枢神经系统中的海马CA1神经元对缺氧最为敏感,同时不同发育时期,大脑对缺氧的耐受能力有所差异,因此本实验选取海马神经元为研究对象,对不同发育阶段p53在缺氧时的作用以及缺氧时p53对其下游基因的调控方式进行初步探讨,以期为大脑缺血缺氧损伤的进一步的研究提供一些线索。目的研究不同发育时期,大鼠海马神经元缺氧耐受性差异的分子机制,以及缺氧时大鼠海马神经元中的p53对其下游基因的转录调控模式,以期为大脑缺血缺氧损伤的进一步研究提供线索。方法将取材于出生后1d和5d的大鼠海马神经元分为常氧组,缺氧组和给药组。神经元培养7天后,进行缺氧处理（0%O2,5%CO2,and 95%N2）12h或24h。药物则在缺氧处理前2h加入培养基中。采用倒置显微镜和NF免疫组织化学法观察细胞生长和形态,比较不同发育阶段大鼠海马神经元耐受缺氧的能力;Trizol法提取细胞中的总RNA,RT-PCR检测相关基因mRNA水平的表达,以了解缺氧应激下ATP依赖的钾离子通道(KATP)与p53信号通路之间的关系。免疫荧光检测膜蛋白UNC5B在各组的表达变化,探讨缺氧应激下p53对UNC5B的调控方式;MTT比色法和AO/EB双染法检测细胞存活率,分析不同处理组之间细胞存活率的差异。结果1.①充氧组中出生后5d大鼠海马神经元生长状态要优于对照组中培养的神经元。②出生后1d以及5d大鼠海马神经元缺氧12h时细胞凋亡率分别为81.04±2.25%（n=6）和89.4±2.197%（n=7）（p＜0.01）;缺氧24h时二者凋亡率分别为74.99±2.751%（n=7）和85.02±2.242%（n=7）（p＜0.01）。③5d海马神经元缺氧耐受能力优于1d大鼠海马神经元。2.①给予细胞KATP通道的激活剂和阻断剂后,通过RT-PCR检测海马神经元中p53下游靶基因mRNA表达水平变化,以了解KATP通道与p53信号通路的关系。缺氧+二氮嗪组中Bax的mRNA表达水平与单纯缺氧组相比明显下降（n=5）（p＜0.01）,在缺氧+甲苯磺丁脲组中Bax的mRNA表达水平相对与单纯缺氧组也有提高（n=5）（p＜0.05）;Fas的mRNA表达水平缺氧+二氮嗪组（n=5）（p＜0.01）和缺氧+甲苯磺丁脲组（n=5）（p＜0.05）与单纯缺氧组比都有差异;缺氧组中α-tubulin的mRNA表达水平与常氧时比明显下降（n=5）（p＜0.01）,缺氧+二氮嗪组和缺氧+甲苯磺丁脲组中其mRNA表达水平与单纯缺氧组相比没有明显差异。②MTT比色法检测细胞存活率。单纯缺氧组,缺氧+二氮嗪组和缺氧+甲苯磺丁脲组的细胞存活率分别是75.7±2.8%（n=7）,55.7±2.5%（n=6）和81.1±2.4%（n=6）,各加药组与单纯缺氧组比较具有显著性差异（p＜0.01）。常氧时,加药组与对照组细胞（n=6）存活率无显著性差异（p＞0.05）。③采用NF免疫组织化学法观察细胞生长和形态。单纯缺氧组,缺氧+二氮嗪组和缺氧+甲苯磺丁脲组的多极神经元的百分率分别是20.6±2.0%（n=6）,26.1±1.7%（n=6）和8.7±1.7%（n=6）,各加药组与单纯缺氧组比较都具有显著性差异（p＜0.01）,常氧时,加药组与对照组细胞（n=6）存活率无显著性差异（p＞0.05）。3.①为了研究p53对UNC5B的调控方式,我们采用RT-PCR分别检测了UNC5B在常氧和缺氧时加入p53抑制剂PFT-α（100nM）和p53激活剂nutlin-3（2μM）时的转录水平。结果显示,与常氧比较缺氧时UNC5B转录水平下降,（p＜0.01,n=5）。常氧时nutlin-3（p＜0.01,n=5）激活UNC5B的转录,而PFT-α对其无显著影响。缺氧时nutlin-3（p＜0.01,n=5）抑制UNC5B的转录,而PFT-α（p＜0.01,n=5）则激活UNC5B的转录。②采用MTT比色法检测细胞存活率。缺氧时细胞存活率（75.0±2.8%）要明显低于常氧时（p＜0.01,n=7）。常氧时PFT-α和nutlin-3都不影响细胞的存活（p＞0.05,n=5）。而缺氧时却不同,PFT-α可以保护细胞免于凋亡（85.2±5.6%）,存活率与单纯缺氧组相比有显著性差异（p＜0.01,n=6）。nutlin-3促进细胞凋亡（57.1±4.1%）,存活率与单纯缺氧组比有显著性差异（p＜0.01,n=7）。③免疫荧光检测各处理组海马神经元上UNC5B的表达水平,实验结果显示与常氧（129.959±21.633,n=122）比较缺氧（104.078±19.058,n=98）时UNC5B蛋白表达水平下降（p=0.000＜0.01）。常氧时nutlin-3（150.014±26.303,n=123）促进UNC5B的蛋白表达（p=0.000＜0.01）,而PFT-α（124.072±28.016,n=106）对其无显著影响（p=0.709＞0.05）。缺氧时nutlin-3（95.244±12.354,n=108）与单纯缺氧组相比显著抑制UNC5B蛋白表达（p=0.002＜0.01）,而PFT-α（104.541±19.080,n=104）同单纯缺氧组比无显著性变化（p=1.000）。结论1.5d大鼠海马神经元分离培养过程中充氧有利于神经元的原代培养,出生后5d大鼠海马神经元缺氧耐受力强于出生后1d大鼠海马神经元。2.实验结果显示:缺氧时KATP通道的开放可保护细胞免受缺氧损伤,并且KATP主要通过影响p53转录激活调控的基因表达来实现对神经元的缺氧保护功能。3.本实验分析了缺氧应激下海马神经元中p53对其下游靶基因的调控方式,并发现缺氧时p53转录激活基因Bax,并转录抑制UNC5B。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 成果
• 致谢