蜡梅（Chimonanthus praecox （L.） Link）冷适应蛋白基因Cpcor413pm1的克隆与功能分析

论文摘要

低温伤害是世界农林生产中损失巨大的一种严重自然灾害，如何减少低温伤害造成的损失已引起各国政府的普遍关注。由于进行植物抗寒（冻）性分子改良具有高效性和针对性，可弥补常规育种技术的不足，加速抗寒（冻）性植物新品种选育进程等优点，因而应用生物技术在分子水平上进行植物抗寒（冻）性遗传改良已成为人们的研究热点。但是，从分子改良的效果来看，能真正达到分子遗传改良植物抗寒（冻）性目的的冷诱导基因甚少。其可能原因除了存在单基因转化、转基因沉默或失活的原因外，缺少与植物抗寒（冻）性密切相关的主效基因是一个重要原因，这可能与冷诱导基因多数来源于模式植物拟南芥等一年生植物有关，如果能进一步拓宽冷诱导基因的来源，比如木本植物，则有可能抓住植物抗寒（冻）性的主要机制，克隆到与植物抗寒（冻）性密切相关的主效基因。 蜡梅（Chimonanthus praecox Link） 原产中国，是第三纪孑遗植物和中国国家二级珍稀濒危植物。12月至翌年早春2月孕蕾开花，于数九寒天，傲然开放于凛冽霜风中，为典型的“冬花”植物，素有“三耐”（耐寒、耐旱、耐剪）与“三不”（冻不坏、旱不死、不缺枝）的称誉，耐寒力极强是蜡梅的最大特点，只要不低于-15℃均能露地安全越冬。本论文从蜡梅花器官中克隆到一个抗寒相关基因Cpor413pm1，并通过在烟草中异位表达分析其功能，取得以下主要结果： 1．蜡梅Cpcor413pm1基因的克隆 在对蜡梅花cDNA文库EST（Expressed Sequence Tag，EST，基因表达序列标签）初步分析的基础上，对EST序列（DW223061）的同源性进行具体分析发现该EST序列对应的基因可能与抗逆相关，特别是可能与抗冷相关。其编码蛋白氨基酸长度可能在200个左右，cDNA序列至少应该大于600个核苷酸。 然后根据EST序列序列设计合成特异引物P1：5’-GAATCCAATAAGCCGAATCAA-3’，P2：5‘-TCTGGGAAGTGACGAGGAAAG-3’，合成文库克隆载体pTriplEx2引物Pλ15’＞AAG CGC GCC ATT GTG TTG＜3’，Pλ25’＞AAG TGA GCT CGA ATT GCG G＜3’，以EST序列DW223061对应

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 植物冷害损伤与抗冷机理研究进展
• 1.1.1 植物寒害机理
• 1.1.2 植物冻害机理
• 1.1.3 植物抗冷机理
• 1.2 植物冷驯化机理研究进展
• 1.2.1 冷驯化的引发
• 1.2.2 冷驯化的功能
• 1.3 冷诱导基因研究进展
• 1.3.1 冷诱导基因的基本特征
• 1.3.2 COR基因分类
• 1.4 低温信号传导与调控途径研究进展
• 1.4.1 冷调控机理和潜在的低温感应子
• 1.4.2 植物低温胁迫信号转导蛋白
• 1.4.3 低温胁迫信号转导和调控途径
• 第2章 引言
• 2.1 研究的背景与意义
• 2.2 论文研究的总体思路
• 第3章 蜡梅冷适应蛋白基因CPCOR413PM1的克隆与分子特性分析
• 3.1 技术路线
• 3.2 材料
• 3.2.1 蜡梅花cDNA文库
• 3.2.2 菌株与载体
• 3.2.3 主要化学试剂
• 3.2.4 主要仪器设备
• 3.2.5 自配的主要试剂
• 3.3 方法
• 3.3.1 EST序列特征分析
• 3.3.2 目标克隆子长度鉴定与Cpcor413pm1基因cDNA获得
• 3.3.3 Cpcor413pm1基因DNA序列的获得及基因结构分析
• 3.3.4 Cpcor413pm1基因拷贝数分析（Southern杂交）
• 3.3.5 Cpcor413pm1基因cDNA的生物信息学分析
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 目标克隆子的EST序列特征
• 3.4.2 蜡梅Cpcor413pm1基因全长cDNA的获得与基因命名
• 3.4.3 蜡梅Cpcor413pm1基因DNA片段克隆与序列特征
• 3.4.4 蜡梅Cpcor413pm1基因的Southern杂交结果
• 3.4.5 蜡梅Cpcor413pm1基因的cDNA序列结构特征
• 3.4.6 蜡梅Cpcor413pm1基因编码蛋白同源性
• 3.4.7 蜡梅Cpcor413pm1基因编码蛋白性质与结构分析
• 3.5 讨论
• 3.5.1 Cpcor413pm1的归类与命名
• 3.5.2 生物信息学分析基因功能的必要性
• 3.5.3 COR413蛋白的结构域特征与功能的关系
• 3.6 小结
• 第4章 蜡梅冷适应蛋白基因CPCOR413PM1的表达分析
• 4.1 技术路线
• 4.2 材料
• 4.3 方法
• 4.3.1 光周期与冷处理
• 4.3.2 茎、叶、花特异表达分析
• 4.3.3 ABA、盐、脱水处理
• 4.3.4 提取RNA
• 4.3.5 RT-PCR分析
• 4.4 结果分析
• 4.4.1 光周期与冷诱导处理
• 4.4.2 时空表达分析
• 4.4.3 其它环境胁迫
• 4.5 讨论
• 4.5.1 RNA质量对反转录的影响
• 4.5.2 短光照和低温对Cpcor413pm1表达的影响
• 4.5.3 时空特异表达
• 4.5.4 ABA、盐与水分胁迫
• 4.5.5 推测调控途径
• 4.6 小结
• 第5章 蜡梅冷适应蛋白基因CPCOR413PM1导入烟草及其抗性分析
• 5.1 技术路线：
• 5.2 材料
• 5.2.1 植物材料
• 5.2.2 菌株与载体
• 5.2.3 主要生化试剂
• 5.2.4 主要仪器设备
• 5.2.5 常用溶液配方
• 5.2.6 基本培养基配方
• 5.3 方法
• 5.3.1 蜡梅Cpcor413pm1植物表达载体构建
• 5.3.2 Cpcor413pm1基因导入烟草及转化植株的获得
• 5.3.3 转基因烟草的检测
• 5.3.4 转基因烟草基本生长发育情况观测
• 5.3.5 转基因烟草低温胁迫试验
• （l）胁迫后萎蔫情况调查
• （2） 胁迫后生理指标测定
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 蜡梅Cpcor413pm1基因植物表达载体的构建
• 5.4.2 转蜡梅Cpcor413pm1基因烟草的获得
• 5.4.3 转基因烟草检测
• 5.4.4 转基因烟草生长发育基本情况
• 5.4.5 转基因烟草低温胁迫后表现
• 5.5 讨论
• 5.5.1 转冷诱导基因对生长发育进程的影响
• 5.5.2 萎蔫指数分析
• 5.5.3 转Cpcor413pm1烟草的抗逆境分析
• 5.6 小结
• 第6章 总结
• 6.1 结论
• 6.2 创新点
• 6.3 下一步工作打算
• 参考文献
• 缩略词
• 附录
• 致谢