海洋拮抗酵母Rhodosporidium paludigenum对果实采后病害生物防治的研究

论文摘要

果蔬采后由致腐性真菌引起的经济损失是巨大的。利用拮抗微生物取代化学杀菌剂,或降低化学杀菌剂的使用量,具有巨大的应用前景,这一领域的研究也是当前采后病害控制的热点。但目前既使是已商业化的生物防治微生物制剂,其效力与化学杀菌剂相比,仍有较大差距。因此,筛选新型高效的酵母拮抗菌,研究其对果蔬采后病害生物防治的效果及其机理,具有重要的理论和现实意义。本课题从中国东海近海海域中分离筛选到一株对果蔬采后病害具有较好抑制效果的海洋酵母,经鉴定为Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman（1984）。本文对海洋酵母R.paludigenum的生长性能、安全性、分离干燥方法及对果蔬采后的主要致病菌和果蔬自然腐烂的抑制效果进行了研究;探讨了该酵母与其它防治手段结合使用对果蔬采后病害抑制效果的影响;初步研究了该酵母对果蔬致病菌的抑制机理及对果蔬贮藏后品质的影响,并将其作为生防制剂用于樱桃番茄采后保鲜中试实验。其主要研究结果如下:（1）从中国东海近海海域中分离筛选到一株对果蔬采后病害具有较好抑制效果的海洋酵母,经英国国际微生物所菌种保存和鉴定中心（CABI Bioscience Identification Services）鉴定为Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman（1984）。（2）对R.paludigenum耐盐性和生长曲线的测定结果表明:R.paludigenum与其它陆地生防酵母相比,具有更高的耐盐性;当氯化钠浓度达到16%时,菌体生长才完全受到抑制,说明该菌株是一株兼性海洋酵母;而且试验结果表明,R.paludigenum在NYDB培养基中28℃下培养时,酵母的生长速度很快,没有明显的延滞期（Lag phase）,到27 h时,酵母细胞数目达到最高值,符合单细胞生长曲线的规律。（3）用R.paludigenum干粉制剂进行了食品级小鼠急性经口毒性实验,初步确定该制剂属于实际无毒类。（4）探讨了不同干燥方法、贮藏条件对R.paludigenum生物活性的影响。试验表明:采用10%脱脂乳作为冷冻干燥保护剂制能提高活性干酵母的存活率;并且在4℃密封保存条件下,活性干酵母的活性能在贮藏的前4个月时间内得到较好的保持。（5）利用R.paludigenum对6种果实的5种主要采后致病菌进行了生防试验:试验表明该酵母可显著抑制链格孢、灰葡萄孢在番茄果实上的侵染;抑制指状青霉、扩展青霉引起的柑橘腐烂;抑制由链格孢引起的冬枣腐烂;抑制灰葡萄孢引起的梨和苹果腐烂;抑制由多毛孢引起的柿子腐烂。同时试验表明,R.paludigenum对病原真菌的抑制效力与其细胞悬浮液的浓度有关,浓度越高,对致病菌的抑制作用也越强。以上结果说明R.paludigenum可能是具有一定广谱抗菌活性的新型生物拮抗菌。（6）对R.paludigenum拮抗机理的研究结果表明,营养与空间的竞争可能是R.paludigenum抑制致病霉菌的主要方式;此外,R.paludigenum能激发与果实抗性相关的酶活性,如POD、PPO等,因此诱导果实的自身抗性可能也是R.paludigenum抑菌机制的一部分。（7） R.paludigenum能和多种防治手段相结合,显著增强对果实采后病害的防治效果:R.paludigenum和适当浓度金属盐类（氯化钠、氯化钙）、多种食品添加剂（碳酸盐、CMC-Na,尼泊金酯钠盐等）结合使用,能降低樱桃番茄、冬枣等果实的腐烂率;该酵母和低剂量杀菌剂嘧霉胺结合使用时,对樱桃番茄灰霉病发病率的控制效果与常规剂量嘧霉胺单独使用时接近;与热处理结合,也能降低对樱桃番茄黑斑病的发病率;此外,试验还表明,1×107 cells/mL R.paludigenum和热处理、尼泊金丁酯钠三种方法结合使用时,对樱桃番茄黑斑病的控制显著低于1×108 cells/mL R.paludigenum单独处理的水平。（8） R.paludigenum单独作用或结合其他防治手段,对樱桃番茄、柑橘、冬枣等果实贮藏时自然腐烂均具有显著的抑制作用;经R.paludigenum处理的樱桃番茄、冬枣和柑橘等果实,其在贮藏期间的品质指标与对照果实相比,没有明显的差异。（9） R.paludigenum对番茄采后病害生物防治中试结果表明,该酵母对樱桃番茄采后灰霉病和黑斑病的防治具有显著的效果,当1×108 cells/mL R.paludigenum和2%氯化钙结合使用,或1×107cells/mL R.paludigenum和低剂量杀菌剂嘧霉胺结合使用时,樱桃番茄黑斑病发病率分别降低了35%和40%,显示了R.paludigenum作为采后生防拮抗菌的潜力。

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致谢

中文摘要

Abstract

简写对照表

第一章文献综述

1 我国果蔬产业发展概述

1.1 我国果蔬生产状况

1.2 我国果蔬贮藏产业发展状况

2 采后主要病原菌及其侵染机制

2.1 果蔬采后病原菌主要侵染途径

2.2 果蔬采后主要病原真菌

2.3 果蔬采后病原真菌主要作用机制

3 果蔬采后病害防治新方法

3.1 化学方法

3.2 物理方法

3.3 生物学方法

4 果蔬采后病害微生物防治

4.1 发展历史

4.2 拮抗剂分离筛选

4.3 生防效果优化

4.4 采后生防机理

4.5 微生物制剂的商品化

5 本论文选题的意义和总体研究设想

第二章拮抗酵母的分离与筛选

1 前言

2 实验材料和方法

2.1 主要仪器

2.2 试剂及培养基

2.3 果实选择与预处理

2.4 病原菌选择与孢子悬浮液制备

2.5 酵母拮抗菌分离来源

2.6 酵母拮抗菌筛选策略

2.7 耐盐性实验

2.8 生长曲线测定

2.9 数据处理与分析

3 结果

3.1 酵母分离结果

3.2 体外筛选

3.3 体内筛选

3.4 耐盐性实验

3.5 生长曲线

4 讨论

第三章海洋酵母R.paludigenum安全性试验

1 前言

2 实验材料和方法

2.1 主要仪器

2.2 试剂及培养基

2.3 菌体培养和制备

2.4 实验动物

2.5 检测方法

3 结果

4 讨论

第四章海洋酵母R.paludigenum干燥试验

1 前言

2 实验材料和方法

2.1 主要仪器

2.2 试剂及培养基

2.3 菌种培养和预处理

2.4 冷冻干燥法及冻干保护剂对R.paludigenum干粉活性的影响

2.5 不同贮藏条件对R.paludigenum干粉活性的影响

2.6 数据处理与分析

3 结果

3.1 冷冻干燥法及保护剂对R.paludigenum干粉活性的影响

3.2 不同贮藏条件对R.paludigenum干粉活性的影响

4 讨论

第五章海洋酵母R.paludigenum对不同果实采后真菌病害抑制效果研究

1 前言

2 实验材料和方法

2.1 主要仪器

2.2 试剂及培养基

2.3 果实选择与预处理

2.4 病原菌选择与孢子悬浮液制备

2.5 R.paludigenum细胞悬浮液制备

2.6 R.paludigenum不同浓度细胞悬浮液对果实采后病害抑制试验（in vivo）

2.7 数据处理与分析

3 试验结果

3.1 R.paludigenum不同浓度细胞悬浮液对樱桃番茄采后病原菌链格孢和灰葡萄孢抑制效果

3.2 R.paludigenum不同浓度细胞悬浮液对柑橘采后病原菌指状青霉和扩展青霉抑制效果

3.3 R.paludigenum不同浓度细胞悬浮液对冬枣采后病原菌链格孢抑制效果

3.4 R.paludigenum不同浓度细胞悬浮液对苹果采后病原菌灰葡萄孢抑制效果

3.5 R.paludigenum对其他水果采后病原真菌体内抑制效果

4 讨论

第六章海洋酵母R.paludigenum对果实采后病原真菌的抑菌机理初探

1 前言

2 实验材料和方法

2.1 主要仪器

2.2 试剂及培养基

2.3 果实选择与预处理

2.4 病原菌选择与孢子悬浮液制备

2.5 R.paludigenum各种处理液的制备

2.6 体外试验（In vitro）

2.7 体内试验（In vivo）

2.8 R.paludigenum在果实伤口生长动态

2.9 R.paludigenum对果实生理的影响

2.10 数据处理与分析

3 结果

3.1 体外试验（In vitro）

3.2 体内试验（In vivo）

3.3 R.paludigenum在果实伤口生长动态

3.4 R.paludigenum对果实生理的影响

4 讨论

第七章海洋酵母R.paludigenum与其它方法结合对果实采后真菌病害抑制效果研究

1 前言

2 实验材料和方法

2.1 主要仪器

2.2 试剂及培养基

2.3 果实选择与预处理

2.4 病原菌选择与孢子悬浮液制备

2.5 不同外源物质对R.paludigenum抑制试验（in vitro）

2.6 不同外源物质对R.paludigenum拮抗活性的影响（in vivo）

2.7 热处理对R.paludigenum抑制樱桃番茄采后病原菌链格孢效果的影响（in vivo）

2.8 多种处理结合对R.paludigenum抑制樱桃番茄采后病原菌链格孢效果的影响（in vivo）

2.9 外源物质对R.paludigenum在果实伤口生长动态的影响

2.10 数据处理与分析

3 结果

3.1 不同外源物质对R.paludigenum生长的影响（in vitro）

3.2 不同外源物质对R.paludigenum拮抗活性的影响（in vivo）

3.3 热处理对R.paludigenum抑制樱桃番茄采后病原菌链格孢效果的影响（in vivo）

3.4 多种处理结合对R.paludigenum抑制樱桃番茄采后病原菌链格孢效果的影响（in vivo）

3.5 外源物质对R.paludigenum在果实伤口生长动态的影响

4 讨论

第八章海洋酵母R.paludigenum对果实自然腐烂抑制效果及对其品质的影响

1 前言

2 实验材料和方法

2.1 主要仪器

2.2 试剂及培养基

2.3 果实选择与预处理

2.4 R.paludigenum对果蔬的自然腐烂的抑制效果

2.5 品质测定

2.6 数据处理与分析

3 结果

3.1 R.paludigenum对果蔬的自然腐烂的抑制效果

3.2 R.paludigenum对果蔬贮藏品质的影响

4 讨论

第九章海洋酵母R.paludigenum对果实采后病害生物防治的中试试验

1 前言

2 实验材料和方法

2.1 主要仪器

2.2 试剂及培养基

2.3 果实选择与预处理

2.4 病原菌选择与孢子悬浮液制备

2.5 R.paludigenum对樱桃番茄采后病害抑制效果中试试验

2.6 数据处理与分析

3 结果

3.1 R.paludigenum对樱桃番茄采后黑斑病中试试验

3.2 R.paludigenum对番茄采后灰霉病中试试验

4 讨论

第十章本论文的主要研究成果及后续设想

1 本论文的主要研究成果

2 创新点

3 后续研究展望

参考文献

作者简介

攻读博士期间发表和待发表的主要论文

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