论文摘要
第一部分人卵巢黄素化壁层颗粒细胞多种细胞因子的表达与卵巢反应性及临床妊娠的关系【研究目的】研究在体外受精—胚胎移植过程中获取的人卵巢黄素化壁层颗粒细胞（mural granulosa cells，MGC）分泌IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-6、IL-17、VEGF、EGF、leptin和bFGF，探讨多种细胞因子表达水平与超促排卵的卵巢反应性及临床妊娠的关系。【材料和方法】1．壁层颗粒细胞标本人黄素化壁层颗粒细胞取自2006年3月至9月在南方医院生殖中心行IVF-ET治疗妇女的卵泡液，共32例，均为输卵管因素或男方因素不孕者。2．壁层颗粒细胞体外培养经拾卵后的所有卵泡穿刺液，用Percoll梯度离心法分离壁层颗粒细胞。根据取卵时平均直径在14mm以上的卵泡数不同，将患者分为卵巢高反应、正常反应和低反应3种类型，即高反应型卵泡数=14个，正常反应型卵泡数5～13个，低反应型卵泡数=4个。按胚胎移植后35天B超检查见胎心搏动分为妊娠组，反之，为未妊娠组。3．Luminex system（LumAvidin Beads）检测运行Luminex检测细胞培养上清液中9种细胞因子：IL-1a、IL-1β、IL-1ra、IL-6、IL-17、VEGF、EGF、leptin、bFGF的浓度。【统计方法】利用SPSS10.0软件进行统计学处理，独立样本t检验比较≤35岁和≥36岁组，妊娠组和非妊娠组组间因子水平的差异。方差分析分析卵巢反应组间因子表达量的差异，用偏相关分析各细胞因子表达量之间，细胞因子与获卵数、成熟卵子数和雌二醇之间的相关性。P=0.05差异有统计学意义。【结果】1．≤35岁组与≥36岁组的IVF患者MGC分泌的IL-6、VEGF、leptin和bFGF有统计学差异（P=0.05）。2．IL-la、IL-6、VEGF与获卵数、成熟卵子数、雌二醇相关关系显著，相关密切。IL-1β、bFGF与获卵数、成熟卵子数相关关系显著，相关密切（P=0.05）。3．根据取卵时卵泡发育数不同进行卵巢反应性分组，卵泡直径为14mm以上的卵泡数≤3个为卵巢低反应组，卵泡数4～13个为卵巢中反应组，≥14个为卵巢高反应组。在卵巢反应分组中，IL-1a、IL-1β、IL-1ra、IL-6、VEGF、leptin和bFGF在组间有显著差异（P=0.05），余因子水平未见差异（P＞0.05）。4．在卵巢正常反应组中，IL-1α和IL-6，IL-1β和IL-1ra、IL-6，IL-1ra与IL-6，IL-6与VEGF相关关系显著，相关密切（P=0.05）。IL-6和leptin负相关关系显著，相关密切（P=0.05）。5．妊娠组与非妊娠组的获卵数、成熟卵子数、雌二醇均没有统计学差异。两组比较，前者MGC的IL-1 ra、EGF分泌水平低于后者，有统计学差异（p＜0.05），而IL-1a、IL-1β、IL-6、VEGF水平高于后者，余因子水平未见统计学差异。【结论】1．随着年龄的增加，高龄患者的MGC分泌的IL-6、VEGF、leptin和bFGF降低。2．IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-6、VEGF、leptin和bFGF在不同的卵巢反应组间有显著差异，提示上述细胞因子与超促排卵的卵巢反应性有关。高反应组的MGC分泌更多的细胞因子。3．通过IVF治疗获得妊娠的妇女比未妊娠者MGC分泌更高的IL-1α、IL-1β、IL-6和VEGF，而IL-1ra和EGF则相反。提示IL-1a、IL-1β、IL-6和VEGF，有利于卵母细胞发育及以后的胚胎生长发育。4．Luminex液相蛋白芯片分析系统具有灵活性好、通量大、灵敏度高、信噪比好的特点，能同时检测到同一样本多个极微量的分子蛋白，比其它的检测方法具有更多优势。第二部分人卵丘细胞多种细胞因子的表达与卵巢反应性及临床妊娠的关系【研究目的】研究体外培养的卵丘细胞（cumulus cells，CC）分泌IL-1a、IL-1β、IL-1ra、IL-6、IL-17、VEGF、EGF、leptin、bFGF的水平，探讨上述多种细胞因子表达与卵巢反应性及临床妊娠的关系。【材料和方法】1．卵丘细胞标本人卵丘颗粒细胞取自在南方医院生殖中心行IVF-ET治疗的妇女，共13例，均为输卵管因素或男方因素不孕者。2．卵丘细胞体外培养取卵后，机械法分离卵子周围的卵丘颗粒细胞团，用0.1％透明质酸酶消化并用吸管反复吹打直至将卵丘颗粒细胞团分散为单个细胞。按活细胞1×104／mL密度接种于24孔培养板中，每瓶加1mL细胞悬液。加入含10％小牛血清的RPMI-1640液lmL后，在95％空气、5％CO2、37℃、饱和湿度条件下培养，细胞贴壁后更换无血清RPMI-1640液，24小时后收集上清液。3．Luminex system（LumAvidin Beads）检测方法同第一部分【统计方法】利用SPSS10.0软件进行统计学处理，独立样本t检验比较妊娠组和非妊娠组组间因子水平的差异。方差分析分析卵巢反应组间因子表达量的差异，用偏相关分析各细胞因子表达量之间，细胞因子与获卵数、成熟卵子数和雌二醇之间的相关性。P=0.05差异有统计学意义。【结果】1．CC分泌的IL-1ra与成熟卵子数相关关系显著，相关密切（P=0.05）；VEGF与获卵数、成熟卵子数、雌二醇相关关系显著，相关密切（P=0.05）。2．根据取卵时卵泡发育数不同进行卵巢反应性分组，卵泡直径为14mm以上的卵泡数≤3个为卵巢低反应组，卵泡数4～13个为卵巢中反应组，≥14个为卵巢高反应组。三组患者间年龄无差异（P＞0.05）。VEGF在组间有显著差异（P=0.05），余因子水平未见统计学差异（P＞0.05）。3．妊娠组与非妊娠组的年龄、获卵数、成熟卵子数、雌二醇及孕酮均没有差异（P＞0.05）。两组卵丘细胞培养上清液中的9种细胞因子水平相近，均未见统计学差异（P＞0.05）。【结论】1．体外培养的人卵丘细胞分泌的IL-1ra水平与成熟卵子数相关，VEGF与卵子数、成熟卵子数、雌二醇正相关，IL-1ra和VEGF可能调节卵母细胞的发育成熟。2．年龄相似的不同卵巢反应性组卵丘颗粒细胞的VEGF表达水平有显著差异，而其它细胞因子未见差异，提示VEGF在卵巢对超促排卵的反应性中发挥了重要作用。3．卵丘细胞分泌的上述9种因子与临床妊娠率无明显关系，提示卵丘细胞表达的上述9种因子不影响IVF—ET的临床妊娠率。第三部分促性腺激素释放激素激动剂对人卵巢壁层颗粒细胞多种细胞因子的调节作用【研究目的】研究在IVF-ET治疗中使用促性腺激素释放激素激动剂对人卵巢壁层颗粒细胞分泌的IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-6、IL-17、EGF、leptin和bFGF的调节作用，探讨GnRHa在IVF-ET中应用的安全性。【材料和方法】1．壁层颗粒细胞标本同第一部分。2．壁层颗粒细胞体外培养MGC培养24小时，观察细胞贴壁后，更换无血清RPMI-1640液，促性腺激素激动剂（Gonadotrophinreleasing hormone agonist，GnRHa）组为培养液中加入GnRHa，终浓度为100pg／ml。培养24h后，收集上清液。3．Luminex system检测同第一部分。【统计方法】利用SPSS10.0软件进行统计学处理，独立样本t检验比较GnRHa组和对照组问因子水平的差异。P≤0.05差异有统计学意义。【结果】比较加入GnRHa（实验组）体外培养的MGC分泌上述细胞因子并与未加GnRHa（对照组）。两组间的获卵数、成熟卵子数、妊娠率无明显差异（p＞0.05）。两组间的上述9种细胞因子分泌水平无统计学差异（p＞0.05）。【结论】GnRHa对MGC表达IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-6、IL-17、EGF、leptin和bFGF无明显影响，提示在IVF治疗中应用GnRHa对卵巢颗粒细胞分泌细胞因子以调控卵母细胞发育无不利作用。
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