猪Toll样受体2基因的克隆及稳定表达细胞系的建立

论文摘要

Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）是1997年才发现的介导天然免疫和获得性免疫的病原模式识别受体,主要参与对微生物病原体相关分子模式的识别。Toll样受体2是Toll样受体家族中功能研究比较多的受体之一,也是TLRs家族中识别配体种类最多的一种受体,在多种微生物所致的急慢性感染中均具有重要作用,因而Toll样受体2被认为是具有中枢性模式识别（central pattern recognition）的受体而得到高度的关注。目前国内、外对人及鼠的Toll样受体2分子研究较多,对猪、牛、羊等经济动物的研究较少,而国内在猪的Toll样受体2研究方面还未有报道。本研究从经植物血凝素（PHA）和脂多糖（LPS）联合刺激的猪肠系膜淋巴结分离的单核细胞中,提取总RNA,利用RT-PCR技术,在国内首次克隆了猪Toll受体2基因。该基因ORF全长2358bp,编码785个氨基酸,富含15.01%的亮氨酸,含有一段23个氨基酸的信号肽序列,是一含胞外区、胞内区和跨膜区的Ⅰ型跨膜受体,与GenBank上登载的猪参考序列（NM213761）的同源性为99.2%。将所克隆的猪Toll样受体2基因的核苷酸序列与其它动物的Toll样受体2基因的核苷酸序列进行遗传演化分析,发现猪与牛、马、羊、狗和人等的同源性最高达80%左右,与家鼠和中国仓鼠的同源性较低,在60-70%之间,而与鸡、牙鲆的同源性最低,分别只有51.2%和33.8%。本研究构建了PcDNA3.1/CT-GFP-pTLR2真核表达重组载体,用脂质体转染法,经G418抗性筛选,成功建立了稳定表达猪Toll样受体2与GFP融合蛋白的CHO-K1细胞系。实验证实:稳定表达目的基因蛋白的CHO-K1细胞与未转染的相比,其细胞形态及生长特征无显著差异,说明表达的融合蛋白对细胞没有明显毒性。免疫组化细胞定位检测显示,阳性克隆细胞的细胞壁有较深的着色,说明猪Toll样受体2的融合蛋白能正确地定位于CHO-K1细胞的细胞膜上,具有跨膜蛋白的生物特性。阳性细胞的裂解产物经SDS-PAGE电泳,后转移到NC膜上进行Western-blot,结果显示表达产物的外源蛋白能被人Toll样受体2抗体所识别,说明表达的外源蛋白具有免疫活性结构。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 中英文缩略词
• 第一篇 文献综述
• 第一章 Toll 样受体研究进展
• 1 TLRs 的发现
• 2 TLRs 分子结构特点
• 3 TLs 成员及其在组织和细胞中的分布差异
• 4 TLRs 家族配体
• 5 TLRs 信号传导机制
• 6 由TLR 介导的生物学功能
• 7 前景和展望
• 第二章 Toll 样受体2 研究进展
• 1 TLR-2 基因组结构和表达
• 2 TLR-2 对PAMPs 的识别
• 3 TLR-2 介导的生物学效应
• 4 前景和展望
• 第二篇 研究部分
• 第一章 猪TLR2 基因的克隆及其序列分析
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 单个核细胞刺激诱导效果
• 2.2 RT- PCR 产物
• 2.3 表达载体的构建与鉴定
• 2.4 基因序列分析及结构预测
• 3 讨论
• 第二章：猪Toll 样受体2 稳定表达细胞系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 重组质粒的鉴定
• 2.2 G418 对CHO-K1 细胞最小致死量的测定结果
• 2.3 重组质粒在CHO-K1 细胞中的表达
• 2.4 阳性单克隆细胞的选择与培养
• 2.5 pTLR2 融合蛋白分子的细胞定位结果
• 2.6 表达产物的免疫活性结构分析
• 3 讨论
• 3.1 TLR-2 分子
• 3.2 真核表达载体的选择
• 3.3 宿主细胞的选择
• 3.4 细胞冷冻保存法
• 3.5 外源DNA 导入哺乳动物细胞常用的方法
• 3.6 阳性高表达细胞克隆的筛选
• 3.7 外源基因的改造与表达策略的选择
• 3.8 启动子和增强子
• 3.9 外源蛋白融合表达与检测
• 第三章 全文总结
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 作者简介
• 导师简介