中药活性成分对肿瘤自杀基因旁杀伤效应及GJIC的影响

论文摘要

恶性肿瘤是严重危害人类健康和生命的重大疾病。基因治疗给恶性肿瘤患者带来了曙光,国外已把基因治疗作为恶性肿瘤常规治疗无效后的一种标准治疗尝试。但十多年来基因治疗的实验和临床研究结果表明,肿瘤基因治疗远未达到人们当初期望的那样有效。自杀基因治疗虽然存在旁杀伤机制,理论上能完全消除肿瘤细胞达到治愈的效果,但由于目前载体转染效率较低、靶向性不够等问题还没有解决,因而未能达到预期的效果,且因病毒载体的使用等带来了一定的毒副作用。如何有效地提高治疗效果,同时减少其毒副作用是目前仍须解决的关键问题。现有研究发现,几乎所有自杀基因系统都存在旁杀伤效应,增强旁杀伤效应能降低对高转染率的需求,减少载体及前体药物用量和毒性,增强基因治疗系统对肿瘤杀伤力。因此,增强旁杀伤效应目前已成为提高肿瘤基因治疗疗效的重要策略。产生旁杀伤效应的主要机制有:缝隙连接细胞通讯（Gap Junctional Intercellular Communication,GJIC）介导,细胞凋亡介导和免疫介导等。根据上述这几种机制,目前形成旁杀伤效应的增效策略主要有:促进GJIC、诱导癌细胞凋亡,提高患瘤机体免疫力等。常用的技术手段包括基因转染法及药物诱导法。中药是一个天然药物宝库,在促进肿瘤GJIC、诱导癌细胞凋亡或提高患瘤机体免疫功能等方面都有优势或潜力,且毒副作用相对较少,从中寻找自杀基因增效药物,建立中西医结合疗法具有可行性。 研究目的意义:本课题选择被报道有促细胞GJIC或诱导癌细胞凋亡作用的抑癌中药成分芹黄素、白藜芦醇、姜黄素,研究其对自杀基因系统是否有协同增效作用,获得有肯定作用的中药成分,探讨其通过GJIC或细胞凋亡机制增强自杀基因旁杀伤效应的药理靶点,阐明其增效的机理,为建立肿瘤基因治疗联合中医药疗法,推进肿瘤基因治疗的临床应用和抗癌中药新药开发打下基础。 1.实验方法: 1.1 中药活性成分对自杀基因旁观者效应影响的体外筛选:MTT法体外检测大鼠肝癌细胞CBRH7919对芹黄素、白藜芦醇、姜黄素的敏感程度,以确定用药浓度。选择对细胞抑制率低的浓度进行实验。上述三种中药活性成分各自以不同浓度与GCV分别或共同作用于大鼠肝癌CBRH7919的tk-细胞,以及含10%tk+细胞的tk+、tk-混合细胞,MTT检测各组存活率,两两比较分析各组存活率的差异和旁观者效应大小,并用金正钧Q值分析中药与自杀基因系统联合的相互作用是否具有协同性。Q值为联合用药时实测药效与理论药效的比值,Q≤0.85为拮抗作用,0.85≤Q<1.15为相加作用,q≥1.15为协同作用。 1.2 对有效中药成分对自杀基因治疗系统增效机制研究:分别用不同浓度的白藜芦醇、姜黄素与GCV分别或共同作用于大鼠肝癌CBRH7919的tk-细胞以及含10%tk+细胞的

论文目录

• 前言
• 第一部分 研究背景
• 1 细胞间缝隙连接细胞通讯与肿瘤关系的研究进展
• 1.1 GJIC的结构及物质基础
• 1.2 GJIC的生理功能及GJIC功能的调控
• 1.3 GJIC与肿瘤
• 1.4 恢复GJIC功能与肿瘤的治疗
• 2. 肿瘤自杀基因治疗的现状与研究发展趋势
• 2.1 肿瘤自杀基因疗法概述
• 2.2 自杀基因疗法的作用机制
• 2.3 肿瘤自杀基因疗法的增效方法
• 3. 促进缝隙连接细胞间通讯（GJIC）的中药及其有效成分的研究
• 4. 调节GJ的中药及其有效成分对肿瘤自杀基因增效作用的研究
• 5. 虎杖中白藜芦醇成分药理作用研究进展
• 5.1 白藜芦醇的药理作用
• 5.2 白藜芦醇抗肿瘤研究概况
• 6. 姜黄中姜黄素成分药理作用研究进展
• 6.1 姜黄素的药理作用研究
• 6.2 姜黄素抗肿瘤研究概况
• 7. 荧光蛋白在分子生物学研究中的应用概况及其在基因治疗中的应用意义
• 7.1. GFP的分子结构与发光机制
• 7.2. 绿色荧光蛋白的修饰
• 7.3. GFP在分子生物学研究中的应用
• 第二部分 实验研究
• 实验一 白藜芦醇与芹黄素对大鼠肝癌细胞及HSV-tk/GCV系统旁观者效应的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3. 结果
• -和CBRH7919/tk⁺对GCV敏感性'>3.1 大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk^-和CBRH7919/tk⁺对GCV敏感性
• +不同混合比例对tk/GCV系统旁观者效应的影响'>3.2 CBRH7919和CBRH7919-tk⁺不同混合比例对tk/GCV系统旁观者效应的影响
• 3.3 芹黄素（API）对 CBRH7919细胞的作用
• 3.4 芹黄素（API）联合tk/GCV系统对大鼠肝癌细胞CBRH7919的杀伤作用
• 3.5 白藜芦醇（RES）对CBRH7919细胞的作用
• 3.6 白藜芦醇（RES）联合tk/GCV系统对肝癌细胞的杀伤作用
• +/GCV）细胞系统作用的流式细胞仪分析'>3.7 白藜芦醇对CBRH7919（10%tk⁺/GCV）细胞系统作用的流式细胞仪分析
• 3.8 白藜芦醇对大鼠肝癌细胞GJIC的影响
• 3.8.1 GJIC抑制剂对白藜芦醇联合tk/GCV系统对CBRH7919杀伤作用的影响
• 3.8.2 白藜芦醇对大鼠肝癌细胞间荧光染料传输功能的影响
• 3.8.3 白藜芦醇对CBRH7919细胞Cx43表达的影响（FITC间接免疫荧光法）
• 4. 讨论
• 实验二、姜黄素对肝癌细胞及HSV1-tk/GCV系统旁观者效应的影响
• 1. 材料
• 2 方法
• 3. 结果
• 3.1 姜黄素对CBRH7919细胞的作用
• 3.2 姜黄素对tk/GCV系统旁观者效应的影响
• +/GCV）细胞系统作用的流式细胞仪分析'>3.3 姜黄素对CBRH7919（10%tk⁺/GCV）细胞系统作用的流式细胞仪分析
• 3.4 姜黄素对大鼠肝癌细胞GJIC的影响
• 3.4.1 GJIC抑制剂对姜黄素联合tk/GCV系统对CBRH7919杀伤作用的影响
• 3.4.2 姜黄素对肿瘤细胞间荧光染料传输功能的影响
• 3.4.3 姜黄素对CBRH7919细胞对Cx43表达的影响（FITC间接免疫荧光法）
• 4. 讨论
• 实验三 HSV-tk绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建及表达
• 1. 材料
• 2 方法
• 3. 结果
• 3.1 pLXSN-tk与pEGFP-N1质粒的酶切鉴定结果
• 3.2 pLXSN-tk经EcoR I/Bam H I双酶切后回收的目的片段经XmaI酶切的电泳结果
• 3.3 重组质粒pTKGFP的酶切鉴定
• 3.4 重组质粒pTKGFP的序列测定结果
• 2.5 细胞的转染和基因的表达观察
• 3.6 GCV细胞毒实验验证酶活性
• 4. 讨论
• 第三部分 结语与展望
• 参考文献
• 附录
• 附图1: pTKGFP测序序列图
• 附件Ⅰ 本论文中使用的缩略语
• 附件Ⅱ 已在学术期刊发表的相关论文
• 致谢