水稻类受体激酶OsAPRLK1的定位和功能研究

论文摘要

盐胁迫作为一种常见的非生物逆境胁迫,极大的影响着植物生长和作物产量。对植物盐胁迫反应机制的研究,对于改善植物的耐盐性,提高作物在盐渍土壤上的生存能力和产量等具有重要指导意义。目前,关于植物盐胁迫反应信号转导机制的研究,多集中在细胞质及细胞膜上信号组分的发现及鉴定,并取得很多进展,而对于细胞外的质外体部分研究较少。随着植物质外体研究的不断深入以及越来越多细胞外多肽信号的发现,植物质外体的功能得到了扩展,它不仅起到细胞和环境间的屏障作用,而且在植物发育和防御各种胁迫中发挥重要功能。本文所研究的水稻质外体类受体激酶（OsAPRLK1）是通过双向电泳及质谱技术系统分析在不同时间进程盐胁迫下水稻根尖质外体可溶性蛋白的变化情况后,发现的一个盐反应上调表达基因。生物信息学分析表明,该基因虽然在数据库中被定义为类受体激酶,但实际分析为仅含有胞外域,而不含跨膜域及激酶域;含有信号肽,可能为分泌型蛋白。OsAPRLK1蛋白序列的主要特点是含两个DUF26结构域,含有该结构域的类受体激酶是整个植物类受体激酶家族中的一类重要分支,其功能研究目前多集中在对病原体的防御反应中,而在非生物逆境胁迫中的作用少有报道。对OsAPRLK1启动子序列分析表明,其启动子区包含多种参与逆境反应的顺式作用元件,提示在非生物逆境胁迫中可能发挥功能。本文针对OsAPRLK1的亚细胞定位、表达模式分析以及功能等方面开展研究。OsAPRLK1-YFP融合蛋白亚细胞定位显示其在细胞质、细胞表面（细胞膜和细胞壁）均有分布。经质壁分离后,在细胞壁部分观察到荧光信号表达,证明OsAPRLK1可能作为分泌蛋白定位在植物细胞质外体区域。通过启动子-Gus的组织定位实验表明,OsAPRLK1可在水稻不同时期的多种组织中表达,特别是幼穗和幼苗中表达水平较高。通过半定量RT-PCR、Real-time PCR和Western Blot等实验,在转录水平及蛋白表达水平,均证明OsAPRLK1受盐胁迫后表达量升高,表明该基因为盐诱导反应基因。进而,通过构建RNAi株系和过表达株系,对OsAPRLK1的转基因纯合水稻株系的盐胁迫生理实验表明,敲减该基因的表达水平,植株的耐盐性在种子萌发和存活率等多项生理指标中有所提高;其体内[Na+ ]/[K+]值、叶绿素含量、MDA含量、气孔关闭度等各种指标也都显示转基因株系的耐盐性提高。此外,利用酵母双杂交体系,我们对OsAPRLK1可能的相互作用蛋白进行了研究,以便对其可能的作用机理进行初步的探讨。以OsAPRLK1的全长编码区作为诱饵,构建水稻cDNA文库,最终筛选到4个可能的相互作用蛋白候选基因。通过酵母体内一对一验证,最终证明普遍胁迫反应蛋白（USP）可能与OsAPRLK1发生了相互作用。这些结果首次表明,OsAPRLK1作为一种可能的质外体的蛋白,参与植物的盐胁迫反应;利用转基因手段将OsAPRLK1表达水平调低之后,可使水稻耐盐性提高,说明植物质外体可能在感受外界逆境刺激及抗盐反应中起着调控作用。这些研究将会使人们对植物质外体蛋白存在和功能的认识更为扩展,并为植物抗逆机制的研究开创新的途径。

论文目录

• 缩写表
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 1 植物盐胁迫的研究进展
• 1.1 盐胁迫对植物的影响
• 1.1.1 膜系统及体内酶类的损伤
• 1.1.2 渗透胁迫
• 1.1.3 氧化伤害
• 1.1.4 离子胁迫
• 1.1.5 代谢失常
• 1.2 植物对盐胁迫的适应性
• 1.2.1 抗氧化作用
• 1.2.2 离子平衡调节
• +和Na⁺的选择性吸收'>1.2.2.1 盐胁迫下植物细胞对K⁺和Na⁺的选择性吸收
• +的排出和区域化'>1.2.2.2 Na⁺的排出和区域化
• 1.2.3 渗透调节
• 1.2.3.1 甜菜碱
• 1.2.3.2 脯氨酸
• 1.3 植物耐盐调控的信号转导机制
• 1.3.1 与离子平衡相关的SOS信号途径
• 1.3.2 促有丝分裂活化蛋白激酶（MAPK）信号途径
• 1.3.3 ABA及转录因子信号途径
• 1.4 展望
• 2 植物细胞外多肽及其信号转导机制的研究进展
• 2.1 系统素（SYSTEMIN）
• 2.2 PSK（PHYTOSULFOKINE）
• 2.3 SCR
• 2.4 CLV3
• 2.5 其他细胞外多肽信号分子
• 2.5.1 细胞外钙调素
• 2.5.2 早期结瘤蛋白40（ENOD40）
• 2.5.3 快速碱化因子（rapid alkalinization factor，RALF）
• 2.6 逆境相关的质外体蛋白质组研究进展
• 3 植物类受体激酶
• 3.1 富含亮氨酸的类受体激酶（LRR-RLKS）
• 3.2 富含半胱氨酸的类受体激酶（CRR-RLKS）
• 3.3 细胞壁连接的类受体激酶（WAK）
• 第二部分 研究论文
• 前言
• 1 水稻类受体激酶（OSAPRLK1）的分子特性分析及亚细胞和组织定位
• 1.1 材料与试剂
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株和载体
• 1.1.3 实验试剂及工具酶
• 1.1.4 培养基
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 水稻幼苗的培养
• 1.2.2 RNA的提取及完整性、纯度、含量的测定
• 1.2.3 RT-PCR扩增相关目的基因
• 1.2.4 目的片段的回收、连接
• 2法细菌感受态细胞的制备及细菌转化'>1.2.5 CaCl₂法细菌感受态细胞的制备及细菌转化
• 1.2.6 细菌质粒DNA的小量提取（碱裂解法）及酶切鉴定
• 1.2.7 引物合成及DNA序列测定
• 1.2.8 基因枪法瞬时表达洋葱表皮
• 1.2.9 农杆菌感受态细胞的制备
• 1.2.10 农杆菌的转化及鉴定
• 1.2.11 水稻愈伤组织培养和遗传转化
• 1.2.12 激光共聚焦及荧光倒置显微镜观察
• 1.2.13 转基因植株Gus染色
• 1.3 实验结果
• 1.3.1 水稻类受体激酶（OsAPRLK1）的分子特性分析
• 1.3.1.1 蛋白序列及结构分析
• 1.3.1.2 同源性分析
• 1.3.1.3 蛋白修饰分析
• 1.3.2 水稻质外体类受体激酶（OsAPRLK1）的亚细胞定位
• 1.3.2.1 RT-PCR克隆OsAPRLK1 全长及表达载体构建
• 1.3.2.2 OsAPRLK1 在转基因水稻中的恒定表达
• 1.3.2.3 OsAPRLK1 在洋葱表皮细胞中的瞬时表达
• 1.3.3 OsAPRLK1 的组织表达定位
• 1.3.3.1 水稻EST数据库中的组织定位信息
• 1.3.3.2 半定量RT-PCR检测OsAPRLK1 的组织表达情况
• 1.3.3.3 Gus染色对OsAPRLK1 进行组织表达定位
• 1.4 讨论
• 1.4.1 分子特性分析表明OsAPRLK1 可能为分泌型DUF26 蛋白
• 1.4.2 亚细胞定位显示OsAPRLK1 是质外体蛋白
• 1.4.3 OsAPRLK1 在水稻各时期的多种组织中表达
• 2 水稻体类受体激酶（OSAPRLK1）的功能研究
• 2.1 实验方法
• 2.1.1 Real-time定量PCR检测基因转录本的表达
• 2.1.2 体外重组蛋白的表达及纯化
• 2.1.3 SDS-PAGE
• 2.1.4 抗体的制备
• 2.1.5 蛋白免疫印迹（Western Blot）
• 2.1.6 蛋白定量
• 2.1.7 转基因水稻纯合体的筛选及逆境胁迫生理试验
• 2.1.8 Southern Blot检测转基因植株T-DNA插入情况
• 2.1.9 种子萌发试验
• +]/[K⁺]'>2.1.10 原子吸收法测定[Na⁺]/[K⁺]
• 2.1.11 叶绿素含量测定
• 2.1.12 MDA含量测定
• 2.1.13 扫描电镜分析叶片气孔变化
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 半定量检测盐胁迫下OsAPRLK1 转录水平变化
• 2.2.2 Real-time PCR检测盐胁迫下转录水平变化
• 2.2.3 免疫印记验证盐胁迫下OsAPRLK1 蛋白水平变化
• 2.2.3.1 构建蛋白表达载体、纯化OsAPRLK1 重组蛋白
• 2.2.3.2 盐胁迫下OsAPRLK1 蛋白水平变化
• 2.2.4 构建RNAi及过表达载体
• 2.2.5 转基因水稻分子鉴定
• 2.2.6 低浓度盐胁迫下转基因植株表型观察
• 2.2.7 盐胁迫下转基因株系种子萌发率
• 2.2.8 高浓度盐处理下转基因株系的存活率
• +]/[K⁺]变化'>2.2.9 转基因株系体内[Na⁺]/[K⁺]变化
• 2.2.10 转基因株系叶绿素含量变化
• 2.2.11 转基因株系MDA水平变化
• 2.2.12 转基因株系叶片气孔变化
• 2.2.13 盐反应基因表达情况
• 2.2.14 转基因愈伤盐胁迫下生长情况
• 2.3 讨论
• 2.3.1 OsAPRLK1 是盐诱导蛋白
• 2.3.2 OsAPRLK1 在植物盐反应中可能具有负调控作用
• 3 水稻类受体激酶（OSAPRLK1）相互作用蛋白的筛选
• 3.1 实验方法
• 3.1.1 酵母感受态细胞的制备
• 3.1.2 LiAc介导的质粒DNA转化酵母细胞
• 3.1.3 酵母质粒提取及鉴定
• 3.1.4 酵母双杂交文库的构建及筛选
• 3.1.4.1 第一链cDNA的合成
• 3.1.4.2 LD-PCR扩增双链cDNA（ds cDNA）
• 3.1.4.3 CHROMA SPIN+TE-400 Column纯化双链cDNA
• 3.1.4.4 共转化法构建酵母文库及筛选鉴定
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 构建诱饵载体和cDNA文库
• 3.2.2 酵母双杂交文库构建、阳性克隆筛选及鉴定
• 3.2.3 筛库阳性克隆的验证
• 3.2.4 USP功能分析初探
• 3.3 讨论
• 3.3.1 酵母双杂交筛库系统的基本原理和优缺点
• 3.3.2 筛库获得阳性克隆的分析
• 结论
• 参考文献
• 个人简历
• 致谢