普通变形杆菌TWN-3株基因文库构建及免疫印迹筛选

论文摘要

长期以来，对水产疫病的控制主要依靠使用各种抗生素和化学药物，但大量使用药物产生的药物残留问题与对食品品质与安全日益严格的要求这对矛盾越发突出。近年来，我国水产品因为药物残留超标而多次出口受阻就是惨痛的教训。不仅造成了巨大的经济损失，而且严重打击了养殖户的生产积极性，影响水产养殖业进一步发展。1991年，Hansen等首先报道了外源基因能够在鲤鱼肌肉组织中表达。1996年，Anderson等第一次报告了带有传染性造血组织坏死症病毒（Infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV）糖蛋白基因的质粒能够在虹鳟中表达，并且能够保护IHNV病毒对受免疫鱼的感染。随后的一些实验也证明，在多种鱼体内，外源基因不仅能够高效，持久地表达，而且能够引起宿主鱼类对外源蛋白的免疫应答。这些为构建鱼类DNA疫苗提供了理论基础。同时对鱼病防治指出了一个新的途径。通过有计划的对养殖鱼类的主要疾病进行疫苗接种可以大大减少抗生素等化学药物在养殖鱼类上的使用量。提高水产品品质和食用安全性，促进我国水产品出口创汇。普通变形杆菌（Proteus.vulgaris）广泛存在于自然界，是一种条件致病菌。由该菌引发的人类疾病国内有较多报道，此类菌对虾、蟹、赤点石斑鱼、鳄鱼等水生生物均具有感染性甚至致死，其中不少品种是水产经济动物。本实验室成功从大口鲇病鱼体内分离出普通变形杆菌TWN-3株，经研究发现其pH和盐的耐受度强，在适宜生长温度范围内生长十分迅速，因此十分容易造成爆发性疾病，对水产养殖生产是一种潜在的威胁。同时研究还发现，该菌株对许多抗生素都不敏感，因此一旦发病，目前的常规鱼病防治手段难以取得明显的效果。尝试用DNA疫苗的方法对其进行预防不失为一个有益的尝试。成功构建DNA疫苗的必须获得相应抗原的主要保护性抗原基因。本研究用带有普通变形杆菌TWN-3株总DNA片段的重组pUC18质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，构建普通变形杆菌TWN-3株DNA文库，获得了3.6×103个带有插入片段的重组子。根据Clarke-Carbon公式，该文库对普通变形杆菌TWN-3株所有基因的覆盖率在99％以上。然后用雄性新西兰大白兔制备普通变形杆菌TWN-3株的多克隆抗血清，采用免疫印迹筛选技术对组成文库的所有重组子进行初筛并对初筛呈阳性反应的重组子进行3次复筛，以排除假阳性的干扰，最终获得了8个稳定呈抗原阳性反应的重组子，为获得普通变形杆菌主要保护性抗原基因及DNA疫苗的研究奠定基础和提供依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究报告:普通变形杆菌TWN-3株基因文库构建及免疫印迹筛选
• 前言
• 第一章 普通变形杆菌TWN-3株基因文库构建
• 1、材料与方法
• 1.1、实验材料
• 1.1.1、菌株和质粒
• 1.1.2、培养基
• 1.1.3、相关酶类与抗生素
• 1.1.4、试剂及其配制
• 1.1.5、相关实验仪器与耗材
• 1.2、实验方法
• 1.2.1、普通变形杆菌TWN-3株复壮与扩大培养
• 1.2.2、普通变形杆菌TWN-3株总DNA提取
• 1.2.3、普通变形杆菌TWN-3株总DNA不完全酶切
• 1.2.4、pUC18质粒提取
• 1.2.5、pUC18质粒酶切
• 1.2.6、pUC18质粒酶切产物去磷酸化
• 1.2.7、重组质粒构建
• 1.2.8、感受态细胞制备
• 1.2.9、转化及筛选
• 1.2.10、文库保存
• 2、结果与分析
• 2.1、普通变形杆菌TWN-3株复壮与扩大培养
• 2.2、普通变形杆菌TWN-3株总DNA的提取结果
• 2.3、总DNA不完全酶切
• 2.4、pUC18质粒提取结果
• 2.5、pUC18质粒酶切结果
• 2.6、重组质粒转化感受态细胞结果
• 2.7、重组子酶切验证结果
• 2.8、文库保存结果
• 3、讨论
• 第二章 普通变形杆菌TWN-3株多克隆抗体制备
• 1、材料与方法
• 1.1、实验材料
• 1.1.1、实验菌株与动物
• 1.1.2、培养基
• 1.1.3、试剂及其配制
• 1.1.4、相关实验仪器与耗材
• 1.2、实验方法
• 1.2.1、普通变形杆菌TWN-3株复壮与扩大培养
• 1.2.2、TWN-3菌悬液制备
• 1.2.3、疫苗制备
• 1.2.4、兔子的免疫方式与免疫周期
• 1.2.5、兔血的采集与血清的分离
• 1.2.6、抗体的测定
• 1.2.7、血清的保存
• 2、结果与分析
• 2.1、血清抗体测定结果
• 3、讨论
• 第三章 普通变形杆菌TWN-3株免疫印迹筛选
• 1、材料与方法
• 1.1、实验材料
• 1.1.1、菌株和质粒
• 1.1.2、培养基
• 1.1.3、相关酶类与抗生素
• 1.1.4、试剂及其配制
• 1.1.5、相关实验仪器与耗材
• 1.2、实验方法
• 1.2.1、与大肠杆菌裂解液共同温浴以除去抗血清中交叉反应性抗体
• 1.2.2、主板与膜的制备
• 1.2.3、复印膜的制备
• 1.2.4、复印膜的处理
• 1.2.5、表达融合蛋白克隆的检测
• 1.2.6、阳性克隆的鉴定
• 2、结果与分析
• 2.1、免疫筛选结果
• 2.2、质粒验证结果
• 3、讨论
• 结论
• 参考文献
• 文献综述:鱼用疫苗研究与应用
• 前言
• 1、疫苗概况
• 2、鱼用灭活疫苗的研究与应用
• 3、鱼用减毒疫苗的研究与应用
• 4、鱼用亚单位疫苗的研究与应用
• 5、鱼用基因工程苗的研究与应用
• 5.1、基因工程疫苗的特点
• 5.2、基因工程亚单位苗
• 5.3、基因缺失活疫苗或突变苗
• 5.4、活载体疫苗
• 6、鱼用DNA疫苗的研究与应用
• 6.1、DNA疫苗的特点
• 6.2、表达质粒的设计与改进
• 6.2.1 表达质粒的设计
• 6.2.2、表达质粒的改进
• 6.3、目的基因的表达
• 6.3.1、表达的时间与效果
• 6.3.2、表达的位点
• 6.4、鱼类DNA疫苗的接种方式
• 6.5、DNA疫苗的免疫应答
• 6.5.1、体液免疫应答
• 6.5.2、细胞免疫应答
• 6.6、免疫效果评估
• 6.7、DNA疫苗的有效剂量和体积
• 6.8、DNA疫苗的生物安全性
• 7、鱼用疫苗的发展方向
• 7.1、改进接种途径及方法
• 7.2、研制多价疫苗
• 参考文献
• 在校期间论文发表情况
• 致谢