论文摘要
目前研究认为,活化的巨噬细胞是可以执行不同功能的复杂群体。其中,替代性活化的巨噬细胞（aaMphi）参与了细胞生长、血管生成、免疫抑制、组织修复和间质形成等过程。肺腺癌间质中有大量肿瘤相关巨噬细胞（TAM）浸润,且与其进展和转移密切相关,而经淋巴道转移是肺腺癌播散的主要途径之一。但是,肺腺癌间质中TAM是否存在替代性活化表型、该活化表型在淋巴管生成中有否作用及其机制尚不明确。本课题拟首先寻找人肺腺癌间质TAM呈替代性活化的证据;进而通过建立小鼠Lewis肺癌（LLC）移植瘤模型等实验明确aaMphi在小鼠肺腺癌淋巴管生成中的作用;最后,探讨aaMphi促进小鼠肺腺癌淋巴管生成的作用机制。本课题旨在为阐明肺腺癌的转移机制提供新的证据,为拮抗肺腺癌淋巴管生成提供新靶点。目的鉴定肺腺癌TAM的活化表型,探讨aaMphi促进小鼠肺腺癌淋巴管生成的机制。方法1、免疫组织化学SP法检测人肺腺癌组织中CD68、血管内皮生长因子（VEGF）-C和血管内皮生长因子受体（VEGFR）-3表达,并计数CD68阳性TAM、VEGF-C阳性指数和VEGFR-3阳性微淋巴管密度（LMVD）,分析其相关性及与临床病理特征之间的关系。2、以CD68阳性作为TAM之标记,以CD68和巨噬细胞甘露糖受体（MMR）双阳性作为aaMphi之标记,以CD68和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）双阳性作为经典活化的巨噬细胞（caMphi）之标记,采用双标免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜鉴定人肺腺癌TAM的活化表型。3、以IFN-γ+LPS或IL-4处理小鼠RAW264.7巨噬细胞,分别建立caMphi或aaMphi模型;观察CpG+IL-10RA能否逆转aaMphi表型。将aaMphi与LLC细胞混合注射至小鼠颈部背侧皮下,建立移植瘤模型;免疫组织化学SP法检测并计数移植瘤LYVE-1阳性LMVD,HE染色检测淋巴结和远处器官转移情况;另取小鼠随机分组计算生存率。4、应用不完全弗氏佐剂（IFA）诱导小鼠腹腔淋巴管瘤形成,消化法分离获得LEC,置于自制鼠尾胶包被的培养瓶（板）中培养。免疫荧光化学法检测LEC表达VEGFR-3和LYVE-1,3H-TdR掺入法检测LEC增殖活力,淋巴管形成实验判定LEC能否形成淋巴管样结构。5、采用transwell系统共培养aaMphi和小鼠LEC,绘制LEC生长曲线,细胞迁移实验观察LEC迁移,基质胶实验观察LEC管样结构形成;实时定量RT-PCR分别检测共培养前后aaMphi表达VEGF-C和VEGF-D mRNA,以及LEC表达VEGFR-3和Prox1 mRNA。之后,选择浓度为100ng/ml的VEGF-C建立aaMphi转分化系统;分别于第0、7、14和28天以实时定量RT-PCR法检测aaMphi表达VEGFR-3、Prox1和Fizz1;连续28天观察管样结构形成情况。最后,采用transwell系统共培养aaMphi和小鼠LLC细胞,免疫细胞化学检测LLC细胞表达VEGF-C,3H-TdR掺入法和transwell侵袭模型分别观察aaMphi对LLC细胞增殖和侵袭的影响。结果1、人肺腺癌TAM计数（103.36±15.31）、VEGF-C阳性指数（20.60±11.96）均明显高于肺良性病变（32.15±5.48,3.82±3.21）（P<0.01）;人肺腺癌VEGFR-3阳性率（54.7%）和肺良性病变VEGFR-3阳性率（50.0%）之间无统计学差异（P>0.05）,但前者VEGFR-3阳性LMVD（11.56±10.73）明显高于后者（4.29±4.18）（P<0.01）。人肺腺癌TAM计数、VEGF-C阳性指数均与淋巴结转移、P-TNM分期密切相关,VEGFR-3阳性LMVD只与淋巴结转移密切相关。人肺腺癌TAM计数和VEGF-C阳性指数、VEGFR-3阳性LMVD之间均呈正相关（r=0.338,P<0.05;r=0.410,P<0.01）;VEGF-C阳性指数和VEGFR-3阳性LMVD之间也呈正相关（r=0.653,P<0.01）。2、40例人肺腺癌组织中TAM均同时表达CD68和MMR,MMR阳性巨噬细胞占全部TAM的74.798.2%;其中,有3例肺腺癌TAM同时表达CD68和iNOS,但iNOS阳性巨噬细胞占全部TAM的比例仅为2.412.7%。在10例肺良性病变中,8例同时表达CD68和iNOS,2例仅表达CD68;未见有同时表达CD68和MMR的病例。3、成功地建立了小鼠caMphi和aaMphi模型,且CpG+IL-10RA能逆转aaMphi为caMphi。与空白对照组比较,aaMphi组和RAW264.7组移植瘤LMVD增高（14.80±3.64,10.50±3.17）,淋巴结转移数较多（10.80±1.32,7.30±0.95）（P<0.01）,双肺转移结节数增多（32.50±4.91,29.30±4.42）（P<0.01）,荷瘤小鼠生存率降低（P<0.01）;其中,aaMphi组LMVD和淋巴结转移数明显高于RAW264.7组（P<0.05）,但双肺转移结节数和荷瘤小鼠生存率之间无统计学差异（P>0.05）。caMphi组和aaMphi+CpG+IL-10RA组移植瘤未见LYVE-1表达和淋巴结转移,双肺转移结节数较少（5.80±1.15,5.17±1.28） （P<0.01）,荷瘤小鼠生存率提高（P<0.01）。4、IFA能诱导小鼠腹腔淋巴管瘤形成,所获LEC活细胞数大于98%,并高表达VEGFR-3和LYVE-1。在自制鼠尾胶包被的培养瓶（板）中,LEC生长状况良好,3H-TdR掺入率明显增加;在鼠尾胶凝胶中,LEC能形成淋巴管样结构。5、与aaMphi共培养后,小鼠LEC增殖、迁移和管样结构形成能力均明显高于空白对照组、caMphi组和RAW264.7细胞组。与共培养前比较,aaMphi表达VEGF-C明显增加（P<0.01）,但表达VEGF-D无明显变化（P>0.05）;LEC表达VEGFR-3和Prox1均明显增加（P<0.050.01）。建立转分化系统之后,小鼠aaMphi表达VEGFR-3和Prox1逐渐增加,而表达Fizz1逐渐下降,至第14天分别达到最高值和最低值;第28天和第14天的情况无明显差别。随着时间推移,aaMphi在基质胶中逐渐形成明显的管样结构。在4个共培养组中,aaMphi组小鼠LLC细胞表达VEGF-C最强,增殖速度最快,侵袭能力最强,RAW264.7组次之;而与空白对照组相比,caMphi组LLC细胞表达VEGF-C无明显变化,增殖和侵袭则受到抑制。结论1、TAM与人肺腺癌组织VEGF-C表达和淋巴管生成呈正相关,可能促进了肺腺癌淋巴结转移。2、人肺腺癌组织中TAM呈现出替代性活化的表型特征。3、aaMphi能促进小鼠LLC移植瘤淋巴管生成、淋巴结和肺转移,并降低荷瘤小鼠生存率。在形成移植瘤的过程中,未经处理的巨噬细胞可以朝着aaMphi的方向极化。CpG+IL-10RA能通过逆转aaMphi表型并最终拮抗小鼠肺腺癌淋巴管生成。4、以自制鼠尾胶为贴黏剂的体系是一种简便、廉价和稳定的小鼠LEC体外培养体系。5、aaMphi能够通过促进LEC增殖、迁移和管样结构形成,直接转分化为LEC和上调LLC细胞表达VEGF-C等三种方式促进小鼠肺腺癌淋巴管生成。
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