兔卵巢组织冷冻复苏后自体移植的实验研究

论文摘要

卵巢是维持女性生殖和内分泌功能的重要器官,化疗、放疗、遗传、感染和自身免疫因素等引起的卵巢早衰给女性带来极大的痛苦。卵巢的冷冻和移植作为恢复女性生殖和内分泌功能的一种手段具有较高的临床价值,特别是对于不可能冻存胚胎或卵母细胞的儿童患者,冷冻保存卵巢皮质是她们唯一的选择。一定数量的卵泡是维持卵巢功能的基础,卵巢组织冻存移植的目标在于不断改进冻存移植技术使移植后获得尽可能多的存活卵泡,更利于移植后卵巢组织功能的恢复及长期维持。目前卵巢组织冷冻移植的研究方向主要包括冷冻方案的优化、最佳移植部位的选择、移植卵巢组织中促性腺激素受体的变化以及卵母细胞的成熟和受精发育潜能的探讨等。卵巢皮质含有丰富的始基卵泡,这些卵泡处于静止状态,代谢率低,无透明带和皮质颗粒,因此可以较好地耐受冷冻。但冻融过程中由于细胞内冰晶的形成和盐的沉积,可导致细胞功能不可逆的损害。最理想的结果是在细胞内形成“玻璃化”,即液体在冷冻过程中不形成冰晶,只呈现出粘度极度增加的一种状态,此过程不发生生物学变化。玻璃化冷冻方法的原理是采用高浓度的冷冻保护剂组成玻璃化保存液,在低温下快速冷冻形成玻璃化状态,完全消除冰晶的形成,玻璃化冷冻技术因其经济、简便和高效而成为该领域的研究热点。在人类辅助生殖领域也出现了玻璃化冷冻技术的应用研究,主要针对人类胚胎和卵子,而卵巢组织玻璃化冷冻方面的研究报道较少。本研究通过比较玻璃化冷冻和慢速冷冻后兔卵巢组织形态学和DNA损伤情况,探讨玻璃化冷冻技术在冷冻卵巢组织方面的应用前景。卵巢组织冻存的目的是将卵巢移植回体内,在一定程度上恢复卵巢的内分泌功能和生育能力。卵巢移植根据供体和受体的关系可分为自体移植、异体移植和异种移植。其中异体移植和异种移植面临的最大问题是免疫排斥反应,因而限制了它们的临床应用。自体卵巢移植临床上适用于患有严重的妇科疾病或肿瘤而并未累及卵巢的患者,可于接受放、化疗前进行卵巢冷冻保存,治疗结束后再行自体移植,从而保留卵巢功能,使卵巢免受放、化疗的损伤。移植部位对保存移植后卵巢功能的恢复及存活至关重要。理想的移植部位应该能够较快地为移植物建立血液供应,有足够的空间并且能提供优良的存活条件,而且便于卵泡监测和取卵或能自然排卵。目前,最佳的自体移植部位尚不确定。自体移植根据移植部位的不同可分为原位移植和异位移植。原位移植是指将卵巢组织移植到盆腔卵巢窝、卵巢蒂位置或卵巢内,但卵巢及其周围由于空间的限制使可接受的移植物数量较少。常用的异位移植部位包括肾被膜下、前臂皮下、乳房组织下、腹直肌筋膜下和腹壁皮下等。肾被膜下因其有丰富的血供而被认为是较好的移植部位之一,但来自于被膜的压力可能会限制生长卵泡的发育。同时研究认为皮下空间温度和压力的变化对卵子会有损伤,可能会影响卵子的质量。子宫系膜,为子宫阔韧带的主要部分,内含丰富的子宫血管、淋巴管、神经及大量疏松结缔组织。其血供丰富（易于建立血液供应）、组织疏松（易于移植并能提供足够的发育空间）且范围广（可容纳较多的移植物）,有望成为较理想的移植位点。本研究将冻融的兔卵巢组织分别移植于子宫系膜内、腹壁皮下及肾被膜下,观察移植后的卵巢组织形态学、超微结构、卵泡生长发育状况,以探讨不同移植部位的移植效果。卵巢移植后,能否接受母体促卵泡素（Follicle stimulating hormone,FSH）和促黄体生成素（Luetinizing hormone,LH）的刺激而迅速发育,取决于存活的卵巢移植物中是否存在促卵泡素受体（Follicle stimulating hormone receptor,FSHR）和促黄体生成素受体（Luetinizing hormone receptor,LHR）。研究卵巢组织移植物中促性激素受体表达的变化有助于了解异位卵泡生长启动和发育的调节机制。本研究通过比较冻融移植前后卵巢组织内FSHR和LHR的变化,以期为移植后促性腺激素的作用机制提供理论依据。近年来陆续有多种动物冻融卵巢组织移植后恢复生殖力的报道,人类也有卵巢组织冷冻复苏后移植成功妊娠分娩的报道。但异位的生长环境是否会对卵母细胞的成熟和受精发育能力造成影响,文献报道的结论不一。为进一步研究冻融移植是否会影响卵母细胞的质量,本研究将复苏的兔卵巢组织自体异位多点移植于子宫系膜内,对冷冻移植后卵母细胞的发育、体内和体外成熟以及受精、卵裂、囊胚形成及染色体异常情况进行观察,以期为进行人类卵巢组织的冷冻移植奠定实验基础。第一部分兔卵巢组织玻璃化冷冻与慢速冷冻的比较【目的】探讨玻璃化冷冻方法对兔卵巢组织冷冻保存的效果。【方法】将30只新西兰雌兔的双侧卵巢切除,每个卵巢的组织块随机分为三部分,分别组成对照组、慢速冷冻组和玻璃化冷冻组,卵巢组织分别进行慢速冷冻和玻璃化冷冻,比较冻融前后卵巢组织学、超微结构、DNA损伤（原位末端标记法,TUNEL）情况。【结果】对照组、慢速冷冻组和玻璃化冷冻组中正常形态卵泡比例分别为87.4%、82.0%和82.7%,两冷冻组正常卵泡比例均低于对照组（P＜0.05）,但两冷冻组间正常卵泡比例比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。各组卵巢组织内的细胞及细胞器均保存良好。对照组、慢速冷冻和玻璃化冷冻组中卵泡凋亡比率分别为21.4%、13.5%和17.1%,各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。【结论】玻璃化冷冻可有效保存卵巢组织的结构,是一种简单、可行的兔卵巢组织冷冻保存方法。第二部分兔卵巢组织不同移植部位移植效果的比较和移植后促性腺激素受体表达的研究【目的】筛选理想的卵巢组织移植部位,并探讨冻融移植后促性腺激素受体的表达情况。【方法】30只切除双侧卵巢的新西兰雌兔随机分为3组,将玻璃化冷冻复苏的卵巢组织分别自体移植到子宫系膜内、腹壁皮下和肾被膜下。30d后取出卵巢组织,通过卵巢组织学、超微结构、以及阴道脱落细胞学检查,观察移植后卵巢组织存活、卵泡生长发育及内分泌功能恢复情况。运用免疫组化ABC法对兔移植前后的卵巢组织中FSHR和LHR分别进行定位染色,结合图像分析系统对冻融移植前后卵巢组织内FSHR和LHR的表达进行分析。【结果】移植术后14-20d兔阴道脱落细胞开始出现规律的周期性变化。子宫系膜内移植组和肾被膜下移植组中卵巢组织的回收率高于腹壁皮下移植组（P＜0.05）。各移植组的正常卵泡比率均低于新鲜组织（P＜0.05）;移植组间正常卵泡和形态改变卵泡所占比率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）;各移植组内均可见不同发育阶段的卵泡,移植组间各级卵泡所占比率比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）;与新鲜组织相比差异亦无统计学意义（P＞0.05）。各移植组卵巢组织内的细胞及细胞器保存良好。各移植组FSHR和LHR受体表达的平均光密度值与新鲜卵巢组织间比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。【结论】冷冻卵巢组织自体多点移植后,卵巢组织形态学和超微结构无明显改变,卵泡存活并正常发育;卵巢组织移植到子宫系膜内和肾被膜下均可以得到良好的效果。卵巢组织冻融移植未影响卵巢促卵泡素受体和促黄体生成素受体的表达。第三部分兔卵巢组织冻融移植后卵母细胞成熟及受精发育能力的研究【目的】探索兔卵巢组织冷冻复苏后移植对卵母细胞生长、成熟、受精发育潜能的影响。【方法】25只性成熟新西兰雌兔随机分为对照组（5只）、新鲜移植组（10只）及冷冻复苏移植组（10只）,两移植组中卵巢组织均自体多点移植于子宫系膜内。卵巢移植90d后对兔联合使用促排卵、体外成熟（IVM）培养和体外受精（IVF）/卵胞浆内单精子注射（ICSI）技术,观察卵子的成熟情况以及体内和体外成熟卵子的受精率、卵裂率和囊胚形成率。【结果】新鲜移植组和冷冻复苏移植组中每高倍视野卵泡数均低于对照组（P＜0.05）;各组间未成熟卵子所占比率以及未成熟卵子体外成熟率比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）;各组间体内成熟卵子、体外培养成熟卵子的受精率、卵裂率和囊胚形成率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）;各组内体内成熟卵子与体外培养成熟卵子的受精率和卵裂率间比较,差异无统计学意义（P＞0.05）,但体外培养成熟卵子的囊胚形成率明显低于体内成熟卵子（P＜0.05）。【结论】兔卵巢经冷冻复苏自体移植后,其卵泡能够重新生长发育,结合体外成熟和体外受精技术体内和体外成熟卵子均可发育至囊胚期。证实卵巢组织冻融移植结合辅助生殖技术可作为一种生育力保存的方法。玻璃化冷冻方法可有效保存兔卵巢组织,因其简单、快捷、无冰晶形成,所以该方法在动物卵巢组织冻存移植乃至开展人类辅助生育研究方面具有良好的应用前景。子宫系膜能为移植物提供良好的生存环境,移植后的卵巢组织形态学和超微结构无明显改变,卵泡存活并正常发育,因此卵巢组织子宫系膜内移植可作为动物实验的有效方法,并有望应用于临床治疗。卵巢组织冻融移植并未影响卵巢组织中促卵泡素受体和促黄体生成素受体的表达。兔卵巢组织能耐受冻融移植过程,其卵泡能够重新生长发育,恢复内分泌功能,且并不影响卵母细胞的成熟、受精发育能力,提示卵巢移植作为储存和恢复女性内分泌和生殖能力的一种方法是可行的,这为人类生殖工程中卵巢组织冷冻移植提供了实验依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 一、卵巢的冷冻保存
• 二、卵巢移植
• 三、卵巢冷冻移植的研究方向
• 第一部分:兔卵巢组织玻璃化冷冻与慢速冷冻的比较
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分:兔卵巢组织不同移植部位效果的比较和移植后促性腺激素受体表达的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第三部分:兔卵巢组织冻融移植后卵母细胞成熟及受精发育能力的研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图表
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的论文
• 外文论文