论文摘要
目的:在原子力显微镜下观察正常乳腺、乳腺增生症及乳腺癌上皮细胞膜的表面结构,探讨乳腺癌形成的机制。测量分析活体乳腺上皮细胞膜表面蛋白的分布情况,从而在一定程度上指导早期乳腺癌的诊断。方法:获取手术切除的人活体乳腺增生症组织、乳腺癌组织、正常乳腺组织各15例,制成细胞印片,所有标本术前均未行任何抗肿瘤治疗。将样本用2%甲醛溶液固定,用蒸馏水反复冲洗,置于洁净空间晾干。样本晾干后置于AFM载物台上,利用Nikon倒置显微镜观察细胞的分散情况,选择细胞进行扫描。选择Tapping模式,调整激光与针尖重合,并将探测器的激光光斑置于中心圆点。在操作软件中进行自动调频,调节探针,直至针尖接触到样本开始扫描。每个病例扫描10个细胞,每个细胞分散扫描10个区域,扫描范围为30μm～1μm,扫描频率为0.5Hz～2Hz。利用AFM图像分析软件,对扫描所得细胞膜表面结构的图像进行分析获得数据平均粗糙度（Ra）、峰值（Peakcount）、高度差（Rp-v）,并对其进行Kruskal Wallis检验,P＜0.05具有统计学意义。结果:AFM下观察到三组细胞膜表面形态结构:正常乳腺细胞膜表面相对平滑,突起较少,在膜上分布稀疏。乳腺增生症细胞膜表面相对粗糙,突起较多,在膜上分布较密集。乳腺癌细胞膜表面更加粗糙,突起在膜上分布密集且有融合趋势,表现为凸起直径的增加。利用AFM图像分析软件对正常乳腺组、乳腺增生组、乳腺癌组细胞膜表面Ra、Peak Count和Rp-v进行测量,每组150个细胞,用Spss13.0对所得参数进行统计（（?）±s）。1正常乳腺组上皮细胞膜表面的Ra、Peak Count和Rp-v分别为9.554±2.001nm、13.180±4.040 nm、33.895±7.347 nm。2乳腺增生组上皮细胞膜表面Ra、Peak Count和Rp-v分别为14.730±3.945 nm、15.647±5.583nm、47.527±14.014 nm。3乳腺癌组上皮细胞膜表面Ra、Peak Count和Rp-v分别为23.040±6.727 nm、16.560±6.227nm、78.436±35.841 nm。统计分析上述数据,比较Ra、Rp-v,三组之间存在显著性差异（P＜0.01）;比较Peak count,增生组和乳腺癌组之间不存在显著差异（P＞0.05）。用AFM软件测量分析标本细胞膜表面的蛋白分布情况,从细胞膜表面的平均Ra、Peak Count和Rp-v的数据分析中可以看到,随着乳腺上皮细胞从正常到增生症再到乳腺癌,膜表面的蛋白逐渐增多增大。这与其功能是相对应的,因为从正常乳腺到乳腺增生症再到乳腺癌,细胞的活跃程度逐渐增加,而活跃程度的增加即可表现在细胞膜表面蛋白的变化上。结论:本实验在世界上首次采用AFM观察人活体乳腺上皮细胞,观察到当乳腺增生时,细胞膜表面的突起增加,突起的形态一致,突起在细胞表面排列细密,有一定的规则性;而当乳腺癌变时可见乳腺细胞膜表面的起伏和皱褶增多,突起大小不一,部分突起直径增大,呈现出融合的趋势。在人的正常乳腺发展到乳腺增生症再发展到乳腺癌这个渐进过程中,细胞膜表面结构亦随之相应变化,即细胞膜蛋白逐渐增多,在AFM图像中相应表现为表面突起逐渐增多、增大甚至融合。本实验首次通过AFM对正常乳腺、乳腺增生症、乳腺癌上皮细胞膜表面结构进行分析,通过AFM观察到从正常乳腺到乳腺增生症再到乳腺癌的细胞膜表面形态结构的变化,该变化为乳腺癌的早期诊断提供了新的辅助手段,并为癌症的单细胞诊断积累了资料,丰富了AFM的细胞膜表面结构数据。