家蚕热休克蛋白Bmhsp21.4基因的研究

论文摘要

热休克蛋白（heat shock proteins,HSP）,一种应激诱导而产生的分子伴侣,有一个80-100氨基酸残基组成α-晶体蛋白结构域,分子量大约在12-43 kD。据分子量大小和功能一般分为三个家族:HSP70、HSP90和小分子热休克蛋白家族。小分子热休克蛋白（small heat shock proteins,sHSP）是一种非常多样性的家族,不同种属的生物体有不同的种类,分子量在15-30 kD。筛选本实验室家蚕蛹期cDNA文库,发现一条已知的家蚕小热休克蛋白的基因Bmhsp21.4。其包含一个564 bp的开放阅读框,编码一个由187个氨基酸残基组成的蛋白,预测分子量为21.4 kD,等电点为5.958。我们将其插入到pET-28a（+）载体,成功构建重组质粒pET-28a（+）-Bmhsp21.4 ,并转化感受态细胞BL21（DE3） ,经IPTG诱导Bmhsp21.4表达,超声破碎细胞后用SDS-PAGE分析,发现在30 kD左右的位置有一条特异性蛋白条带。SDS-PAGE结果显示该蛋白部分以可溶形式存在,经层析纯化后和质谱分析,得到该重组蛋白的分子量为24.862 kD,证实了该蛋白表达的正确性。用纯化的蛋白免疫雄性新西兰大白兔,获得多克隆抗血清,效价达1:6400以上。应用Western blotting及RT-PCR分析家蚕五龄幼虫的脂肪、精巢、卵巢、皮、气管、马氏管、丝腺、中肠和头部等组织及卵、幼虫、蛹和蛾四个时期中BmHSP21.4的分布,我们在很多组织中检测到了明显的信号,而在头部、皮及精巢的信号很弱。热激试验中,以温度为梯度,研究五龄幼虫中丝腺、马氏管及头部三个组织中BmHSP21.4蛋白在正常和受激后的表达变化情况,当热激温度达到40℃-45℃时BmHSP21.4表达量最大。以热激时间为梯度,同样对五龄幼虫丝腺、马氏管及头部三个组织进行热激,研究其在不同温度下BmHSP21.4蛋白量的变化情况,发现热激时间为2.5 h-3 h时BmHSP21.4表达量明显高于其它热激时间。最后利用家蚕卵巢细胞BmN研究BmHSP21.4在细胞中的间接免疫荧光实验,BmHSP21.4主要存在于在细胞核中,还有一部分存在胞质。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一章 热休克蛋白的研究进展
• 引言
• 1 热休克蛋白的发现及研究
• 2 热休克蛋白的特点
• 3 热休克蛋白的生物学功能
• 3.1 分子伴侣的作用
• 3.2 HSP 对细胞起保护作用
• 3.3 抑制细胞凋亡
• 3.4 维持细胞内重要遗传物质及蛋白稳定
• 3.5 磷酸化作用
• 3.6 与人类疾病的关系
• 4 小结
• 第二章 实验方案设计
• 1 研究目的和意义
• 2 研究内容
• 3 实验流程图
• 3.1 原核表达及分布情况
• 3.2 热激实验
• 第三章 生物信息学分析
• 1 材料及工具
• 2 方法
• 2.1 Bmhsp21.4 基因的获得
• 2.2 Bmhsp21.4 基因的序列分析
• 3 结果
• 3.1 Bmhsp21.4 基因的序列
• 3.2 BmHSP21.4 蛋白的保守域分析
• 3.3 BmHSP21.4 蛋白的疏水性分析
• 3.4 BmHSP21.4 蛋白跨膜区预测
• 3.5 BmHSP21.4 蛋白的信号肽分析
• 3.6 BmHSP21.4 蛋白的功能位点分析
• 3.7 BmHSP21.4 蛋白二级结构分析
• 3.8 BmHSP21.4 蛋白高级结构分析
• 3.9 BmHSP21.4 蛋白定位分析
• 3.10 BmHSP21.4 同源序列多重比对分析
• 3.11 BmHSP21.4 进化树的构建
• 3.12 电子表达谱分析
• 4 讨论
• 第四章Bmhsp21.4 基因克隆及原核表达
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂及仪器
• 1.3 试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 引物的设计
• 2.2 质粒提取
• 2.3 PCR 扩增
• 2.4 PCR 产物的纯化
• 2.5 双酶切PCR 产物与pET-28a（+） 载体及回收
• 2.6 连接反应
• 2.7 制备感受态细胞
• 2.8 转化
• 2.9 重组克隆的筛选与鉴定
• 2.10 重组质粒转化E.coli BL21（DE3）
• 2.11 检测重组质粒在大肠杆菌中表达
• 2.12 SDS-PAGE 电泳分析
• 3 结果
• 3.1 PCR 扩增目的片段
• 3.2 重组质粒的PCR 扩增及双酶切鉴定
• 3.3 测序
• 3.4 重组蛋白的诱导表达情况
• 4 讨论
• 第五章 重组蛋白的纯化和多克隆抗体的制备
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 His 柱亲和层析纯化重组蛋白
• 2.2 纯化重组蛋白透析除盐
• 2.3 重组蛋白的FPLC 纯化
• 2.4 重组蛋白分子量的质谱鉴定
• 2.5 测蛋白含量
• 2.6 制备抗原
• 2.7 免疫动物
• 2.8 多克隆抗血清制备
• 2.9 间接ELISA 法测定多克隆抗血清效价
• 3 结果
• 3.1 重组蛋白的诱导表达及纯化
• 3.2 重组蛋白分子量的质谱鉴定
• 3.3 抗体效价测定
• 4 讨论
• 第六章 BmHSP21.4 蛋白在家蚕中的表达分布
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 Western blotting 样品的获得
• 2.2 Western blotting 检测Bm HSP21.4 蛋白的分布
• 2.3 总RNA 的提取
• 2.4 cDNA 的合成
• 2.5 荧光定量PCR 引物的设计
• 2.6 荧光定量PCR
• 2.7 荧光定量PCR 数据分析
• 3 结果
• 3.1 五龄幼虫各组织中mRNA 量的比较
• 3.2 家蚕发育过程中mRNA 量的变化
• 3.3 Western blotting 分析家蚕五龄幼虫各时期中BmHSP21.4 的分布
• 3.4 Western blotting 分析家蚕五龄幼虫各组织中BmHSP21.4 的分布
• 4 讨论
• 第七章 热激实验
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 2 热激后BmHSP21.4 在5 龄期组织中的表达
• 3 结果
• 4 讨论
• 第八章 亚细胞定位
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢